Изготовление самостоятельное: Самостоятельное изготовление шкафа-купе

Содержание

Самостоятельное изготовление шкафа-купе

Наверняка, хотя бы раз в жизни любой мужчина всерьез задумывался над тем, можно ли изготовить шкаф-купе самостоятельно по своему проекту? Конечно, немало и тех, кто предпочитает купить встроенный шкаф-купе, не теряя при этом уйму сил и времени. Но на самом деле разработать дизайн шкафа-купе и сконструировать его вовсе не тяжело благодаря множеству онлайн-уроков и четких инструкций.

На данный момент невероятной популярностью пользуется ДСП, который предназначен для изготовления качественной и стильной мебели. Кроме ДСП, для успешного изготовления шкафа-купе вам также понадобятся электроинструмент и фурнитура, которые вы без труда можете приобрести в любом строительном супермаркете.

Итак, приступаем к разработке формы будущего шкафа-купе. Для этого вам понадобится раскроить ДСП по нужным вам размерам каждой детали и подходящей к вашему интерьеру цветовой гамме. Будьте внимательны, составьте общий список абсолютно всех комплектующих деталей шкафа и их размеры. Также необходимо учитывать и размеры выбранной вами фурнитуры, ведь от ее параметров сильно зависят многие детали вашего будущего шкафа, а количество полок, ящиков и прочих конструкций обеспечит комфорт в эксплуатации любого шкафа.

На сегодняшний день большинство деталей шкафов-купе соединены между собой специальными еврошурупами, которые вкручиваются с помощью специального конфирматного сверла.

Что касается дверей вашего будущего шкафа-купе, то к их выбору и дальнейшей сборке, необходимо подойти более чем серьезно, ведь двери шкафа-купе характеризуют его внешность, а их правильная установка существенно продлит срок эксплуатации готовой мебели. Важно определиться с профилем двери, поскольку и от его качества будет зависеть, насколько долго прослужит вам ваш шкаф.

Стоит учесть, что для изготовления своего собственного шкафа-купе вам не обойтись без измерительных приборов, с помощью которых ведутся расчеты, шуруповерта и качественного перфоратора, а также дополнительных ключей различного диаметра.

Собрать шкаф-купе – задача ответственная и не требует спешки. Вначале нужно собрать короб шкафа, основные и мелкие его составляющие. Установите все внутренние элементы, и только потом следует приступать к установке фурнитуры.

Чтобы установить фасады, вы сначала закрепите верхнюю направляющую готовой раздвижной конструкции, а нижнюю – просто уложите без закреплений. Далее – устанавливаете дверь. И ваш собственноручный шкаф-купе готов!

САМОСТОЯТЕЛЬНОЕ ИЗГОТОВЛЕНИЕ ОПАЛУБКИ | Deloteh

Возведение любого, хоть, сколько-нибудь значительного объекта, размерами превышающего небольшой сарайчик, потребует закладки фундамента и возведения стен. Желание получить долговечное сооружение должно подвигнуть начинающего строителя на ознакомление, причем в достаточно обширном объеме, с основными строительными правилами и законами. Недостаток финансовых средств чаще всего является причиной решения взяться за дело самому. К чему платить весьма не малые суммы посторонним лицам, если можно попробовать заложить фундамент и проделать всю последующую работу силами семьи и друзей. Ну что же, в таком случая давайте начнем обучение.

Что может потребоваться?

Первым делом следует понять, что собой представляет опалубка для фундамента. Если совсем просто, это набор из предметов и деталей, нужных для придания будущему фундаменту требуемой формы и размеров. Создав подобное сооружение, его применяют на всех почти этапах стройки. С нижних уровней и до крыши. Бывают ситуации, при которых опалубку не разбирают вообще, и она так и остается в качестве неотъемлемой детали строения. В целом, можно выделить несколько разнообразных способов ее изготовления:

  • Уже описанная выше, не демонтируемая опалубка является частью стационарной, не перемещаемой в процессе стройки.
  • Вторым важным типом является разбираемая и переставляемая конструкция, изготовляемая из крупноразмерных деталей и используемая многократно.
  • К третьему типу относиться подвесная опалубка. Ее плюсом служит не обязательность существования вертикальных опор.
  • Широко применяется при возведении многоэтажных домов скользящая опалубка. С ее помощью появляется возможность не прерывать работу на стройке.

Еще одним вариантом служит катящаяся опалубка, схожая по конструкции со скользящей, но в отличии от нее наращиваемая в горизонтальном направление. Изготовление опалубки важный, ответственный и трудоемкий процесс. К выбору материалов для ее сооружения подойти надо со всей серьезностью. Общим требованиям ко всем им служит прочность и простота в обработке. К примеру, опалубка для ленточного фундамента чаще всего делается из дерева. Возводить высотные здания удобней с помощью металлических плит. Наиболее распространенные материалы таковы:

  • Древесина и древесные плиты разных видов. Она проста, доступна, не требует особых усилий при монтаже. Если вы строите сами, это лучший, оптимальный вариант. Дерево не долговечно, но в частном доме нет такого объема работ, что бы ее возможностей было не достаточно.
  • Стальные конструкции. Очень хорошо выдерживают весовую нагрузку, прекрасно держат форму и заданные размеры. Много весят и очень дороги, что не позволяет использовать их в частном строительстве.
  • Алюминиевые. Легче стали и проще в эксплуатации. Но хуже выдерживают типоразмеры.
  • Каркас из пластика. Относительно недавно появившаяся, но уже не плохо себя зарекомендовавшая технология. Ленточная опалубка довольно часто изготовлена этим способом.

Понятно, в принципе, что самостоятельно проще всего изготовить деревянный вариант или пластмассовый. Простые решения доступны многим, обладающим даже не значительной подготовкой, домашним умельцам, Но не во всех случаях надо экономить.

Когда лучше обратиться к профессионалам?

В работе неизбежно возникают «трудные» для новичка моменты. Опалубка для лестницы уже достаточно сложный, хотя и не являющийся непреодолимым, момент строительства. Ответственность заключается, прежде всего, в том, что лестница важный элемент интерьера дома.Ошибка, неточность приведут к трудно устранимым последствиям. Ведь все на виду. Так же не стоит браться за другие, требующие особой точности, виды работ. Двух этажный или еще больший дом может потребовать применения строительной техники. Тут уже проще и дешевле позвать на помощь специалистов.

Мебельные шаблоны и кондукторы: назначение, виды, самостоятельное изготовление

Как хорошо заменить монотонную длительную работу, а ещё ту, которая требует точности, простыми действиями. При изготовлении мебели на её качество и внешний вид влияет сборка. Важным этапом, предшествующим сборке, является разметка крепёжных и посадочных отверстий. Для облегчения этих технологических операций и служит шаблон мебельный или кондуктор.

Назначение мебельных кондукторов

Основное назначение — помощь в точной разметке под сверление и само точное сверление. Для первого предназначены шаблоны, для второго кондукторы. Мебельные шаблоны и кондукторы не только позволяют достичь качественной разметки и точности, но и существенно сэкономить время. Будучи неизменным приспособлением в производстве, они позволяют достичь максимальную эффективность при выполнении однотипных операций. Используя кондуктор, удаётся решить довольно серьёзную проблему: вхождение сверла в обрабатываемое изделие не под правильным углом.

Выбор мебельных приспособлений очень широк. Они выпускаются различными производителями, могут быть как универсальными, так и служащими для определённых операций. В то же время многие мастера изготавливают свои виды приспособлений, необходимых для операций с продукцией собственного ассортимента.

Виды шаблонов

Мебельный кондуктор является, по сути, шаблоном. Поэтому будем рассматривать только его. В простом исполнении представляет собой устройство в виде планки с отверстиями, в которые вставлены гильзы. Гильза предназначена для направления сверла и не даёт ему изменить соосность.

Кондукторы, в зависимости от места применения, различаются по видам:

  1. Накладные. Получили своё название благодаря способу использования. При работе они накладываются на деталь с последующей фиксацией или без неё. Основное назначение — это применение с плоскими заготовками.
  2. Поворотные. Шаблоны используются для выполнения отверстий на цилиндрических формах обрабатываемых деталей. Эти кондукторы могут менять своё положение как по вертикальной, так и по горизонтальной оси. Эта возможность позволяет делать отверстия под разными углами.
  3. Опрокидываемые. Этот тип предназначен для одновременного сверления в нескольких плоскостях.
  4. Скользящие. Характеризуются универсальным применением по расположению к месту сверловки, не требуют закрепления. Вся операция заключается в простом прикладывании его к месту разметки.

В качестве приспособления при изготовлении мебели особую популярность получил накладной тип

. Материал, применяемый для их изготовления, различный, начиная от пластика и заканчивая инструментальной сталью. Можно приобрести как готовое заводское исполнение, так и выполнить его самостоятельно.

Кроме того, при изготовлении мебели часто применяют специализированные кондукторные приспособления (такие как шкантовое устройство для сборки и приспособление, дающее возможность без отклонений высверливать отверстия под конфирматы).

Фирменные кондукторы

Производители мебельной фурнитуры выпускают свои виды кондукторов. В основном предлагаются универсальные конструкции, соответствующие европейским стандартам мебельных креплений. Необходимо понимать, что серийные устройства будут стоить недешево.

С их помощью можно быстро и точно выполнить отверстия для установки различных элементов мебели или соединения её частей между собой.

Популярными производителями являются такие как:

  • blum;
  • hettich;
  • wolfcraft;
  • virutex;
  • assistant.

Простое приспособление стоит недорого, поэтому если планируется серийное использование, стоит рассмотреть возможность его приобретения. Если возникает необходимость в сборке одноразового изделия или требуется выполнить нестандартное отверстие, то экономически целесообразно будет изготовить его самостоятельно. Кроме того, своими руками можно сделать инструмент, который прослужит долгое время и будет удобен для домашнего использования.

Самостоятельное изготовление приспособления

Самостоятельно изготовить кондуктор проще всего для выполнения одного вида операций. Рассмотрим, как изготовить кондуктор под конфирмат. Сверление и разметка отверстий под конфирматы является основной операцией при сборке любого вида мебели.

Необходим брусок, выполненный из металла, сечением 12×12 мм. В данной заготовке необходимо сделать ряд отверстий, точность сверления отверстий будет пропорциональна и точности всего изделия. Диметр сверла должен быть равен диаметру конфирматного сверла. От края бруса отмеряем 8 мм, а от торца заготовки 32 мм. Лучше всего для замеров использовать линейку-угольник. На пересечении линий делаем углубление керном. И просверливаем строго вертикально насквозь.

Для комфортности работы необходимо добавить упор. Последний делается из пластины толщиной 0,7 мм, отрезаем полоску 25— 30 мм и загибаем под углом 90 градусов. Следующим этапом будет соединение двух заготовок. Лучше использовать винты под диаметр М6, предварительно нарезав резьбу в теле бруса. Два винта вкручиваем по длине, а один в торец. Отрезаем согнутую часть пластины вровень с телом бруса. На торцах нашего самодельного кондуктора приклеиваем вкладки для создания прямого угла между брусом и пластиной. Приспособление готово. Видео изготовления можно посмотреть по адресу www. youtube.com/watch?v=Jlng_r6rfKk

Вместо металлического бруса можно использовать и деревянный. Для отверстий под сверло применяют подшипники с внутренним диаметром 4,5 и 8 мм или втулки из латуни.

Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что качественное изготовление мебели практически невозможно без использования кондуктора. Приобрести последний для сверления отверстий проще в магазинах, занимающихся продажей мебельной фурнитуры, или у различных представителей производителей. Цена кондуктора напрямую связана с конфигурацией, материалом изготовления и фирмы производителя.

Но если вы взялись самостоятельно изготовить мебель, то не должно возникнуть проблем с изготовлением самодельного кондуктора.

Commercial, содержание и художественный фильм производства

Адам Шенкман

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959387/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=3a2d58d2f6b8b79ed93d32f008634e3e8c32f02ab3f637b66bc92544470c9bb1

Бен Аффлек

https: // игрок .vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623085/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=f04126f51ea4b74691e51a0a28e6020df12f22091e293ecc0864439c88bd6322

Клэр Скэнлон 9player2vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959389/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=43e6d2126f4ce0a32be7be1d7c9c48fbb3b43c3dce0191b6351fd22dad3e91fe

Дэвид Эйер

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959398/rendition/540p/540p.mp4 ? LOC = внешняя и подпись = e18aacb5f4c8a5c0dfcb59998885e33d3f30d62b57ff68cd412b38608bb9b85f

Дэвид Франкель

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959406/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=bc0c0f3545db234b6820d1d9416341a9c515786a575d8bd58710d19cd270e347

Дэвид Джелб

https: // игрок.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959416/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=f594cbc806be6171004172012ae238db5f13476604c4a5987f4611a21fc271cc

Дуг Лиман

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959419/rendition/540p/540p.mp4 ? LOC = внешний и подпись = 16331b0e0c14fc32e5a7130e0e21eb41297b35cf77d53ce3f631a56b0b3773ad

Greg Daniels

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959428/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=34ebcde36a471a71ab56efefeda4b484b1aa7cc3a6b0a58ac774c623dac60a0a

Гильермо Арриаг

https: // игрок.vimeo.com/progressive_redirect/playback/673408210/rendition/540p?loc=external&signature=4974e70bb45744fa811ae81c6394d128482788b970ef776643334a807fe29d54

Isabel Bethencourt

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/673408205/rendition/540p?loc=external&signature=d9d17ebd9475d293bf78225d993499ea32ac1deaee613a92a36f6d206f3e36d3

Джейми Баббит

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623077/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=0010865af5dff5b05f74d5be2951dbf05c43eab89d7f9dad07ee5ba6d8c://playerz.kaminskius

vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623076/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=ba5a245f980b60452d5ef55721bd9bbe7afa957df95a130e89d2c50257931c26

Жан-Пьер Жене

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623075/rendition/540p/540p ? .mp4 LOC = внешняя и подпись = 8039f7998eb8f31c8dd42b43deb5b37cc8a2d75b458d5a63158afeaa8357ba7b

Дженнифер Селотта

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959432/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=798cbe87fa4105dd459b22fd0ad3b65487bd2dfe26bea33be5962090d7d563bc

Kevin Bray

https: // игрок .vimeo.com/progressive_redirect/playback/673408196/rendition/540p?loc=external&signature=8b4458e08839e6bb5f2b9195335ed9c1ebc7db03312d623d41f2cc92be7a6f29

Matt Reeves

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959438/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature = 33cd74de92fe6266f9754bbb4cf75dfa0a1f758ef33efaee498ce0f0b8f

Мауро Фиоре

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959443/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=25efbd259a85a8347a1483f9ea7256fa093d1b258b52b3570489b67da73dc780

Нед Бенсон

https: // игрок.vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623056/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=2f35435934d371db34dfeff7b1b8df7370bd5d4dbc719fbb4c032f420f8f8573

Либерштейн

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959454/rendition/540p/540p.mp4 ? LOC = внешняя и подпись = 5143a91f5969e5e758a00ae4de5d499d986a2c19c9460dcc56abe92045a12e7b

Peter Chelsom

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959465/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=5bbcc598a1a7d3f82e6c6cef11eb162777ecf399e4067884d17d698714611036

Regina King

https: // игрок.vimeo.com/progressive_redirect/playback/673408186/rendition/540p?loc=external&signature=d34edb4829c5528325c68452ef913100c682b81004545e59a26b8aa1dece538e

Сара Полли

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/670959474/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature = a2fcc2406e09ffd75479ed464917d69a1d4e5757592a4f74abd82be59751de3c

Сиан Хедер

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623052/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=3000f66f0f672a369ec498aa9a9a00fdbb72f6132708a902e8090c5d2d9cc797

Simon Crane

https: // игрок.vimeo.com/progressive_redirect/playback/673408182/rendition/540p?loc=external&signature=5fa579df2b847571efe425ab3e8eb0e68d65b9319c31decdcf8c34f30cc40137

Tony Goldwyn

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623045/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature = dad48c7e1282885e5d4277d969c1c76827ffad4756c588980f20b19fe60da3fa

Tucker Gates

https://player.vimeo.com/progressive_redirect/playback/672623040/rendition/540p/540p.mp4?loc=external&signature=6eb0632e5eb6a48cd384f8daaec9d28c539a32dcc27e69484a8d36f749c9938c

Wade Иствуд

https: // игрок.vimeo.com/progressive_redirect/playback/673408168/rendition/540p?loc=external&signature=d33b678401455a4051638460a3ceeeb4a6d748a2e8884f8bfaa034d2d16436e9

В естественных условиях микробной стимуляции вызывает быстрый лиганд CD40-независимое производство интерлейкина 12 с помощью дендритных клеток и их перераспределения в областях Т-клеточных

Ранняя индукция интерлейкина (IL)-12 является критическим событием в определении развития как врожденной резистентности, так и адаптивного иммунитета ко многим внутриклеточным патогенам.Предыдущие исследования in vitro показали, что макрофаги (MPhi) являются основным источником исходного IL-12, продуцируемого при микробной стимуляции, и что этот ответ способствует дифференцировке CD4+ лимфоцитов защитных Т-хелперных клеток 1 (Th2) из ​​предшественников, которые праймированы на антигенсодержащие дендритные клетки (ДК). Здесь мы демонстрируем с помощью экспериментов по иммунолокализации и проточно-цитометрического анализа, что, вопреки ожиданиям, DC, а не MPhi, являются начальными клетками для синтеза IL-12 в селезенке мышей, подвергшихся in vivo воздействию экстракта Toxoplasma gondii или липополисахарида, двух лунок. охарактеризованы микробные стимуляторы цитокинов.Важно отметить, что эта продукция IL-12 происходит очень быстро и не зависит от примирования гамма-интерферона или сигналов от Т-клеток, таких как лиганд CD40. Продукция ИЛ-12 селезеночными ДК сопровождается увеличением количества ДК, а также перераспределением в области Т-клеток и приобретением маркеров, характерных для интердигитирующих дендритных клеток. Способность DC селезенки, но не MPhi, синтезировать de novo высокие уровни IL-12 в течение нескольких часов воздействия микробных продуктов in vivo, а также способность тех же стимулов индуцировать миграцию DC в области Т-клеток, свидетельствует о том, что ДК функционируют одновременно как антигенпрезентирующие клетки, так и вспомогательные клетки, продуцирующие IL-12, в инициации клеточно-опосредованного иммунитета к внутриклеточным патогенам.Эта модель избегает необходимости задействовать взаимодействие трех клеток для дифференцировки Th2 и указывает на DC как на сторожевой механизм для врожденного распознавания, так и на диктатора выбора класса в последующем адаптивном ответе.

Что входит в независимое кинопроизводство?

Независимое кинопроизводство обычно связано со многими или всеми теми же проблемами, что и любой другой тип кинопроизводства, хотя и в другом масштабе и с некоторыми другими соображениями.Фильмы, в том числе снятые независимо, обычно начинаются с периода подготовки к съемкам, когда дорабатывается сценарий и собираются актеры и съемочная группа. Затем следует производство, в котором фильм фактически снимается, как правило, за более короткое время и с меньшим бюджетом, чем студийный фильм. Затем производство обычно переходит в постпродакшн, в ходе которого выполняется монтаж, дорабатываются любые звуковые и визуальные эффекты, и фильм завершается.

Основное различие между независимым кинопроизводством и студийным кинопроизводством заключается в том, что независимый фильм не имеет финансовой поддержки со стороны студии во время производства.Многие из тех же проблем возникают при производстве независимого фильма, но в меньшем масштабе и с более ограниченным бюджетом. Большинство постановок начинается с пре-продакшена, когда сценарий фильма завершается, собираются актеры и съемочная группа, а перед съемками выполняются другие приготовления. Это может включать в себя разведку мест, поиск и переодевание по мере необходимости, а также приобретение необходимого оборудования, такого как камеры и оборудование для аудиозаписи.

После этого независимое кинопроизводство обычно продолжается собственно производственной фазой создания фильма.Это предполагает совместную работу актеров и съемочной группы, чтобы запечатлеть сцены, необходимые для фильма и аудио, чтобы в конечном итоге собрать их в законченный фильм. В производстве обычно задействовано наибольшее количество людей, работающих над фильмом одновременно, а также, как правило, это самая дорогая часть производственного процесса из-за большего количества людей, работающих над фильмом. Независимое кинопроизводство обычно выполняется гораздо быстрее, чем студийное кинопроизводство, поскольку актеры и члены съемочной группы часто получают почасовую или дневную оплату.

После завершения этапа производства независимое кинопроизводство обычно переходит к постпродакшну для завершения фильма.На этом этапе выполняются все специальные визуальные эффекты, необходимые для фильма, а сам фильм редактируется в окончательный вариант. Аудио к фильму доработано и смонтировано, синхронизировано с визуалом, добавлена ​​музыка. После завершения постпродакшна в независимом кинопроизводстве часто участвуют кинематографисты, которые ищут дистрибьютора, который может помочь профинансировать расходы, необходимые для распространения фильма в кинотеатрах для публичного просмотра.

Недавние изменения в независимом производстве и временном финансировании кино- и телепроизводства в Канаде

В 2003 г. в канадской индустрии независимого производства произошел спад из-за конвергенции вялого рынка продаж, повышенного общественного интереса к реалити-программам, сокращения государственного поддержка и иностранная конкуренция за глобальное производство долларов.В 2004 году этот «идеальный шторм» бушевал и становился все сильнее, и год также стал свидетелем дальнейших масштабных изменений, затронувших канадскую промышленность: (i) все более агрессивные меры, принимаемые другими юрисдикциями для привлечения производственных долларов; (ii) закрытие производственного подразделения Alliance Atlantis, которое когда-то было крупнейшим в Канаде; и (iii) более строгие требования для участия в нашем договоре о совместном производстве с Великобританией, нашим крупнейшим англоязычным партнером по совместному производству.

Рассмотрим судьбу телевизионного фестиваля в Банфе, который проводится ежегодно в июне.За несколько недель до 25-летия мероприятия организаторы фестиваля объявили, что фестиваль находится на грани срыва, среди прочего, из-за последствий атипичной пневмонии, «коровьего бешенства» и, как следствие, падения посещаемости и доходы от спонсорства. Вмешательство группы инвесторов в последнюю минуту спасло фестиваль на 2004 год, и есть планы продолжить фестиваль в последующие годы. Многие отраслевые обозреватели не могли не провести прямую параллель между состоянием канадской индустрии и бедами фестиваля в Банфе.

Лучшим лучом надежды среди темных туч стал выдающийся успех книги Дени Аркана Les Invasions Barbares (Варварские вторжения ) . Премьера фильма Аркана состоялась на Каннском кинофестивале 2003 года, где он получил награду за сценарий и награду за лучшую женскую роль. На церемонии вручения премии «Оскар» в феврале фильм получил «Оскар» как лучший фильм на иностранном языке — это первый канадский фильм, получивший эту награду. Позже в том же году фильм доминировал в «Джини», канадской версии «Оскара», где получил шесть главных наград.Успех Les Invasions Barbares является положительным доказательством здоровья франкоязычной киноиндустрии в Канаде по сравнению с ее англоязычным аналогом.

Несмотря на этот успех, статистика производства в Канаде за 2004 год показала заметное снижение по сравнению с предыдущими годами, особенно в традиционно крупных производственных центрах, таких как Ванкувер, Торонто и Монреаль. Хотя часть продукции, обычно производимой в этих городах, переместилась в региональные центры, такие как Виннипег и Галифакс, большинство участников отрасли считают, что общий уровень производства снизился.

ОТВЕТНЫЕ МЕРЫ И РАЗРАБОТКИ КАНАДЫ: УСИЛЕНИЕ КАНАДСКИХ НАЛОГОВЫХ КРЕДИТОВ

Федеральный налоговый кредит на содержание, известный как канадский налоговый кредит на кино- или видеопродукцию, рассчитывается как процент канадских трудовых затрат, понесенных канадским продюсером в связи с приемлемое производство. Когда этот кредит был введен в 1995 году, процент составлял 25% от соответствующих канадских трудовых затрат, которые были ограничены 48% приемлемого производственного бюджета, что давало кредит в размере до 12% приемлемого производственного бюджета.В ноябре 2003 г. предел расходов был увеличен до 60% приемлемого производственного бюджета, что дало кредит в размере до 15% приемлемого производственного бюджета. Статистических данных, позволяющих определить влияние изменений на федеральный контент, пока нет, но продюсеры, безусловно, приветствовали это увеличение.

Федеральный налоговый кредит на производственные услуги («PSTC») рассчитывается как процент от квалифицированных канадских затрат на оплату труда, понесенных владельцем авторских прав в соответствующем производстве или поставщиком производственных услуг, нанятым таким владельцем авторских прав.После отмены в сентябре 2001 г. налоговых убежищ на производственные услуги федеральное правительство обязалось увеличить PSTC. В феврале 2003 г. PSTC был увеличен с 11% до 16% квалификационных расходов на рабочую силу в Канаде. Первоначальная реакция на увеличение была положительной, но к концу 2004 г. деятельность в сфере производственных услуг резко снизилась в Ванкувере, Торонто и Монреале. Уменьшение является достаточно значительным, чтобы поставить под вопрос долгосрочные последствия увеличения PSTC в 2003 году.

ИЗМЕНЕНИЯ В НАЛОГОВОМ КРЕДИТЕ «ПРАВИЛА ДЛЯ ИНВЕСТОРОВ»

Налоговый кредит федерального содержания содержал положения, которые ограничивали выплату такого кредита, когда неправомочный «инвестор» мог требовать налогового вычета в отношении соответствующего производства.Эти «правила для инвесторов» были специально разработаны для того, чтобы производители не могли получить доступ как к налоговым скидкам на содержание, так и к преимуществам продажи ускоренных налоговых вычетов инвесторам. Хотя правила для инвесторов разрешали определенные инвестиции «предписанным лицам», такие как инвестиции государственных киноагентств или вещательных компаний, имеющих лицензию Канадской комиссии по радио, телевидению и телекоммуникациям («CRTC»), большая часть частных инвестиций была исключена. Кроме того, последствием разрешения инвестиций кому-либо, кроме назначенного лица, является то, что налоговый кредит на содержание сводится к нулю.

Канадские производители изначально были готовы принять четкую грань между налоговыми кредитами и частными инвестициями, потому что именно они лоббировали в правительстве введение налоговых кредитов на содержание в качестве альтернативы частным инвестициям, ранее доступным через налоговые убежища. Однако никто не был уверен, насколько широко будут толковаться или применяться правила для инвесторов. В 1999 году Агентство по доходам Канады («CRA») распространило проект руководящих принципов для налогового кредита на содержание, предполагая, что любое приобретение бенефициарного интереса в авторских правах на производство будет противоречить правилам инвестора.Одним из результатов такой интерпретации было то, что вещательные компании, дистрибьюторы, таланты и другие получатели участия в чистой прибыли могли считаться неприемлемыми инвесторами, что явно не входило в первоначальную цель законодательства о налоговых кредитах на контент.

В ноябре 2003 г., после обширных консультаций с участниками отрасли, федеральное министерство финансов («Финансы») предложило поправки, уточняющие правила для инвесторов. Эти поправки отменили общий запрет для инвесторов, требующих налоговых вычетов в отношении производства, и заменили его конкретным запретом на инвестиции в налоговую защиту.Уточнив, что именно инвестиции в убежище от налогов должны быть исключены из режима налоговых кредитов на содержание, Министерство финансов попыталось усилить первоначальную законодательную цель такого режима.

К сожалению, предлагаемые поправки к правилам инвестора не изменили положения в содержании положений о налоговом кредите, которые исключают получение кредита «исключенной продукцией». Исключенные произведения включают те, на которые канадец не является владельцем всемирных авторских прав в течение первых 25 лет после завершения.Эта ссылка на авторское право может позволить CRA запретить налоговые льготы на контент, если он считает, что инвестор получил выгоду от авторских прав, несмотря на усилия финансового отдела по разъяснению правил.

Участники отрасли сожалеют о том, что неопределенность все еще существует, но с оптимизмом смотрят на то, что Министерство финансов продолжит свои усилия по разрешению частных инвестиций в производство канадского контента путем пересмотра роли владения авторскими правами в канадском контенте в целом.

TELEFILM CANADA И CAA

Весной 2004 года Telefilm Canada, канадское федеральное агентство, отвечающее за содействие производству фильмов канадского содержания, предприняло смелый шаг, начав пилотный проект с Creative Artists Agency (CAA) ), электростанция Беверли-Хиллз. Цели проекта CAA двояки: во-первых, репатриация канадских талантов, проживающих за границей; и, во-вторых, помочь канадским продюсерам привлекать таланты, находить финансирование и распространять свои фильмы.В обмен на услуги САА канадский производитель будет платить САА вознаграждение в размере до 1% от производственного бюджета, в зависимости от оказанных услуг. Есть надежда, что, используя ресурсы такого агентства, как CAA, канадские продюсеры смогут создавать канадский контент с кассовыми сборами. Еще слишком рано оценивать успех пилотного проекта, который продлится до весны 2005 года, но участники индустрии будут очень внимательно следить за его влиянием на кассовые сборы.

ПРОДОЛЖЕНИЕ ВАЖНОСТЬ МЯГКИХ ДЕНЕГ

Поскольку дистрибьюторы и вещатели по-прежнему неохотно идут на значительные предпродажные авансы или обязательства, производители должны финансировать образовавшийся дефицит из других источников.Как и в предыдущие годы, наиболее привлекательным источником средств для завершения финансирования были «мягкие деньги», средства, которые генерируются другими способами, помимо продажи продукции (например, налоговые льготы, продажа с обратной арендой, фонды акций). Эти стимулы можно разделить на две общие категории: прямые стимулы, такие как кредиты на заработную плату, скидки с налога с продаж и снижение или отмена налога на капитал, и косвенные стимулы, которые предназначены для поощрения частных инвестиций, такие как ускоренная или льготная амортизация.Как бы вы ни называли это, эти «мягкие деньги» продолжают оставаться важным дополнением к более традиционным источникам коммерческого финансирования, таким как авансовые платежи за распространение, минимальные гарантии и плата за лицензии на вещание.

В 2004 году продолжалось распространение льготных денежных поощрений в юрисдикциях за пределами Канады. Эти новые источники включают введение 20-процентного налогового вычета в Венгрии, увеличение числа штатов США, предоставляющих налоговые льготы, и, что вызывает особую озабоченность, предлагаемый закон, введенный Соединенными Штатами.С. федеральное правительство направлено на сокращение так называемого «неуправляемого» производства.

Это может удивить сторонних наблюдателей, но возросшая доступность источников мягких денег не смогла пробудить искру в отрасли в Канаде. Канадские производители «контентной» продукции во многих случаях были лишены доступа к новым источникам мягких денег в различных частях мира в результате ограничений, применимых к их продукции. Следует отметить, что объем, уместность и ценность этих ограничений все чаще ставятся под сомнение участниками отрасли.Между тем, канадские продюсеры, полагающиеся на продукцию иностранного производства, не наблюдают роста своего бизнеса из-за факторов, варьирующихся от продолжающейся популярности реалити-программ до жесткой конкуренции за выездные съемки. Заинтересованные стороны отрасли выразили обеспокоенность тем, что, если уровень производства продолжит снижаться, Канада столкнется с эрозией своей инфраструктуры кино- и телеиндустрии, на создание которой ушли десятилетия.

ТРУДНОСТИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МЯГКИХ ДЕНЕГ

У канадских производителей нет иного выбора, кроме как попытаться получить доступ к любым мягким деньгам, где только возможно.Результатом, как свидетельствуют транзакции, в которых мы участвовали, являются структуры финансирования, которые представляют собой сложные и хрупкие лоскутные одеяла из источников мягких денег, отсрочек продаж и производителей (много отсрочек!). В современных условиях простого финансирования производства просто не существует — времена финансирования из двух-трех источников давно прошли.

Каждое производство состоит из сотен элементов, многие из которых являются движущимися мишенями до того дня, когда производство действительно начнется.Во многих случаях «ниточки», связанные с мягкими деньгами, могут нежелательно отвлекать людей, работающих над фильмом. Производители теперь тратят меньше времени на производство, чем на общение с бухгалтерами, юристами и государственными чиновниками в разных часовых поясах. Такое распределение энергии может иметь серьезные последствия для производства.

В начале 2004 г. сложилась ситуация, которая продемонстрировала неустойчивое положение производителей, которые в силу рыночных условий должны максимально расширить свой доступ к источникам мягких денег.10 февраля 2004 г. Министерство внутренних доходов Великобритании («Налоговое управление») объявило, что оно будет запрещать расходы, заявленные некоторыми товариществами с ограниченной ответственностью, инвестирующими в кино, фактически прекращая деятельность таких товариществ. Эти противоречивые партнерские отношения до даты объявления предоставляли своим инвесторам отсрочки по уплате налогов, а продюсерам предоставляли до 35% бюджета соответствующего фильма. Налоговая служба считала, что их объявление не должно было застать кого-либо врасплох, но в результате были немедленно отложены или закрыты многочисленные проекты, которые полагались на финансирование от партнерств и не могли заменить его в короткие сроки.

Эффект от шага Налогового управления ощущался даже в Канаде, где производители канадо-британского по соглашению о совместном производстве под названием «Речной король» осталась картина, уже находящаяся в стадии подготовки, и дефицит бюджета фильма составил 30%. Эффект домино, вызванный изъятием такой значительной суммы денег, был немедленным и разрушительным для фильма. Если фильм не будет финансироваться, как планировалось, его статус официального совместного производства по англо-канадскому договору может оказаться под угрозой, что приведет к потере дополнительного финансирования в зависимости от статуса совместного производства, что приведет к еще большему дефициту.Производство было остановлено на несколько недель, поскольку продюсеры пытались реструктурировать и возродить фильм, что они в конечном итоге и сделали после многих, многих часов напряженной работы, и все это под угрозой полного закрытия фильма. То, что произошло с «Речным королем», иллюстрирует трудности, связанные с производством в сегодняшних условиях, когда акцент смещается с кинопроизводства на соблюдение множества правил и положений, необходимых для получения доступа к финансированию. Кроме того, это указывает на потенциальную опасность полагаться на агрессивные схемы мягких денег, которые могут преждевременно потерять благосклонность правительств.

ПРЕПЯТСТВИЯ ДЛЯ ОБЪЕДИНЕНИЯ СТИМУЛОВ

Несмотря на постоянную важность финансирования за счет мягких денег, канадским производителям контента часто приходится выбирать между максимальным использованием канадских стимулов и доступом к финансированию за счет мягких денег, поскольку эти источники финансирования в некоторых случаях несовместимы. Таким образом, в то время, когда финансирование в виде мягких денег в изобилии, канадские производители не могут пользоваться полным доступом, особенно в США, Великобритании и Германии.

Поощрение США s Система договорного совместного производства изначально была разработана, чтобы позволить иностранным производителям конкурировать с США.С. производства. В результате между Канадой и ее крупнейшим производственным партнером, США, нет договора о совместном производстве. Режим «совместного предприятия» CRTC разрешает определенные виды совместного производства между канадскими и американскими партнерами квалифицироваться как канадский контент для целей вещания, но такие совместные предприятия обычно не квалифицируются как канадский контент с точки зрения налоговых льгот или других стимулов, таких как финансирование от Канадского телевизионного фонда или Telefilm Canada.

В результате канадским производителям часто приходится выбирать между производством без U.партнер S., который может разрешать доступ к поощрениям в Канаде, но лишает доступа к поощрениям в США, и действует в качестве поставщика производственных услуг для производителя из США, что может разрешать доступ к поощрениям в США, но исключает доступ к поощрениям в Канаде. Учитывая недавний рост стимулов в США, некоторые участники отрасли предположили, что, возможно, пришло время рассмотреть промежуточную позицию, такую ​​как налоговая скидка для совместных предприятий Канады и США, возможно, по ставке ниже, чем кредит содержания, но больше, чем кредит на услуги.

Поощрение Великобритании с. В течение последних нескольких лет Великобритания была основным источником финансирования мягких денег. Британские поставщики услуг по продаже с обратной арендой и британские фонды акций нацелены на производителей по всему миру, включая Канаду, в качестве потенциальных бенефициаров их финансирования. Как отмечалось выше, канадские производители нашли способ объединить эти британские стимулы со своими собственными канадскими стимулами, тем самым значительно увеличив финансирование «мягких денег» в своих бюджетах. К сожалению, вещи, которые кажутся слишком хорошими, чтобы быть правдой, часто таковы: The U.Правительство К. объявило об изменениях в правилах совместного производства, которые могут запретить канадцам доступ к британским источникам финансирования «мягких денег». В 2003 году Министерство СМИ, культуры и спорта Великобритании объявило, что с 5 января 2004 года минимальное участие Великобритании в англо-канадских совместных проектах будет составлять 40%, в отличие от минимума в 20%, установленного в Канаде. ВЕЛИКОБРИТАНИЯ. договор о совместном производстве. Поскольку большинство канадских стимулов основано на уровне канадских расходов, повышенные требования к расходам в Великобритании сократят количество доступных канадских стимулов, что сделает американскую.K. менее привлекательное направление для канадских производителей. В результате источники мягких денег в Великобритании стали менее доступными для большинства канадских производителей.

Немецкий инсентив с. Немецкие фонды чистой прибыли и акционерного капитала являются привлекательным источником мягкого денежного финансирования как для производителей, так и для немецких инвесторов. Хотя между Канадой и Германией существует договор о совместном производстве, немногие из этих немецких фондов готовы финансировать совместное производство Канады и Германии, поскольку правила договора требуют, чтобы авторские права на такие производства принадлежали обоим сопродюсерам.Поскольку налоговый вычет, которого добиваются инвесторы в этих немецких фондах, основан на владении авторскими правами, совместное владение, требуемое договорными правилами, приведет к уменьшению или запрету налоговых льгот для инвесторов. В результате канадские производители не могут сочетать свои канадские стимулы с немецким финансированием «мягких денег».

ЗАГАДКА АВТОРСКОГО ПРАВА

Авторские права занимают центральное место в большинстве канадских стимулов для контента, включая договорные правила совместного производства, администрируемые Telefilm Canada.Однако большинство структур финансирования мягких денег требуют, чтобы финансисты владели авторскими правами или контролировали их на каком-то этапе производственного процесса. Задача канадских продюсеров состоит в том, чтобы убедить регулирующие органы, в том числе CAVCO, Telefilm Canada, CRA, которые управляют различными программами налоговых льгот, и их провинциальные эквиваленты в том, что передача ограниченного интереса в авторском праве финансисту, финансирующему мягкие деньги, не должна дисквалифицировать производство. от того, чтобы считаться канадским содержанием. Например, У.Студии S., которые чрезвычайно изощренны и очень чувствительны к проблемам пиратства, успешно получили доступ к фондам акций Германии и Великобритании, проводя различие между простыми авторскими правами, которые сохраняются за фондом акций, и более экономически ценными правами на распространение, которые сохраняются. по студиям.

Какой подход является правильным: точка зрения, согласно которой голые авторские права могут быть обменены на деньги без изменения фундаментальной природы предмета производства, или противоположная точка зрения, согласно которой производитель не может распоряжаться даже простыми авторскими правами? Мы считаем, что последняя позиция устарела и служит только для того, чтобы сковывать в других отношениях предпринимательскую отрасль.Мы считаем, что канадские власти заслуживают серьезного рассмотрения роли авторского права, особенно в свете текущих экономических факторов, влияющих на эту отрасль.

БОЛЬШЕ КОНКУРЕНЦИИ ДЛЯ КАНАДЫ

В то время как льготные деньги влияют на структурирование сделок канадскими производителями, стимулы также играют очень важную роль в определении того, какие производства — прежде всего США — выбирают Канаду в качестве своего местоположения. Снижение уровня производства в Канаде связано с целым рядом факторов, но четыре ключевых фактора стали предметом обсуждения многих отраслевых обозревателей.Во-первых, растущая озабоченность в США по поводу «офшорных» рабочих мест политизировала страх США перед «безудержным» производством, что привело к согласованным усилиям по сохранению американского производства дома. Во-вторых, растущая сила канадского доллара по отношению к доллару США и другим иностранным валютам сделала Канаду менее привлекательной для иностранных производителей. В-третьих, увеличение числа стран, конкурирующих за привлечение такого же количества продукции за счет использования налогов или других стимулов. В-четвертых, сохраняющаяся популярность реалити-шоу привела к тому, что меньшее количество постановок покинуло США.S. -наш крупнейший источник зарубежной продукции.

Что еще хуже, в октябре 2004 года Конгресс США принял закон, известный как Закон о создании рабочих мест в Америке . Следующая остановка для принятия закона — Белый дом, где он, скорее всего, будет подписан. В этом законопроекте Конгресс нацелился на так называемое «безудержное» производство и предложил меры, которые, как они надеются, побудят определенных кино- и телепродюсеров снимать свои продукты в США. то, что мы знаем до сих пор: (i) вместо использования метода текущего прогноза доходов для амортизации затрат на фильмы, стоимость квалификационных производств будет разрешено немедленно списывать в год, когда происходят расходы, что аналогично налоговый режим, мотивирующий огромные инвестиции немецких средств массовой информации в Голливуд; (ii) не менее 75% стоимости производства должно приходиться на услуги, оказываемые в США.С.; и (iii) предлагаемое законодательство будет применяться только к отвечающим требованиям фильмам или телепрограммам, стоимость которых не превышает 15 миллионов долларов США (20 миллионов долларов США в определенных определенных областях).

При разработке этого закона законодатели США в значительной степени заимствовали успехи таких стран, как Австралия, Великобритания и Канада, в привлечении иностранного производства и сосредоточили свое внимание на том типе производства, который, скорее всего, выиграет от съемок за границей. Является ли это законодательство и налоговые льготы, предлагаемые всеми, кроме девяти U.С. государства имеет влияние, на которое надеялись, еще предстоит увидеть. Однако ясно, что США выбрали путь поощрения частных инвестиций в свою кино- и телеиндустрию в сочетании с существующими государственными стимулами — аналогично ситуации в Канаде до 2001 года. поставщики производственных услуг часто превозносят перед своими американскими соседями два основных достоинства канадских местоположений: географическую близость и выгодный обменный курс.Однако рост производства в США в более отдаленных странах, таких как Австралия, Новая Зеландия и Южная Африка, продемонстрировал, что, хотя географическое удобство является важным фактором, финансовые соображения не менее важны при выборе местоположения. К ноябрю 2004 года канадский доллар превысил 0,82 доллара США, обменный курс не наблюдался с 1993 года и значительно превышал курс от 0,64 до 0,68 доллара США в период с 1998 по 2002 год, период, в течение которого иностранное производство в Канаде значительно и устойчиво росло. .Конечно, обменный курс между Канадой и США редко является определяющим фактором при выборе местоположения в Канаде, но он может склонить балансовую сумму в пользу вариантов с аналогичным расположением. Если канадский доллар сохранит свой нынешний уровень, тогда другие элементы «пакета» канадского производства должны будут поддерживаться или корректироваться, чтобы вернуть производство в Канаду.

 

Тетрациклин повышает экспрессию ЦОГ-2 и выработку простагландина Е2 независимо от его влияния на оксид азота — пораженный хрящ (в присутствии или в отсутствие цитокинов и эндотоксина) в условиях ex vivo.Точно так же бычьи хондроциты, стимулированные LPS, показали (от одного до пяти раз) увеличение накопления PGE

2 в присутствии доксициклина. Этот эффект наблюдался при концентрациях препарата, которые не влияли на выработку оксида азота (NO). В мышиных макрофагах (RAW 264.7), стимулированных LPS, тетрациклины ингибировали высвобождение NO и увеличивали продукцию PGE 2 . Тетрациклин(ы) и l- N -монометиларгинин (l-NMMA) (ингибитор NO-синтазы) продемонстрировали аддитивный эффект в отношении ингибирования накопления NO и PGE 2 , тем самым разъединяя эффекты тетрациклинов на NO и PGE 2 производство.Усиление продукции PGE 2 в клетках RAW 264.7 под действием тетрациклинов сопровождалось накоплением как мРНК циклооксигеназы (ЦОГ)-2, так и цитозольного белка ЦОГ-2. В отличие от тетрациклинов, l-NMMA в низких концентрациях (≤100 мкМ) ингибировал спонтанное высвобождение NO в пораженных остеоартритом эксплантатах и ​​макрофагах, стимулированных ЛПС, но не оказывал существенного влияния на продукцию PGE 2 . При более высоких концентрациях l-NMMA (500 мкМ) ингибировал высвобождение NO, но увеличивал продукцию PGE 2 .Это исследование указывает на новый механизм действия тетрациклинов для увеличения экспрессии ЦОГ-2 и производства PGE 2 , эффект, который не зависит от эндогенной концентрации NO.

Доксициклин и миноциклин относятся к тетрациклиновым антибиотикам широкого спектра действия. В последние годы было установлено, что тетрациклины, которые быстро всасываются и имеют длительный период полувыведения, оказывают биологическое действие независимо от их антимикробной активности 1 .Такие эффекты включают ингибирование MMPs 3 , 2, 3 , экспрессию NOS 4 , прогрессирование опухоли, резорбцию кости 5, 6 , ангиогенез 7 и воспаление 8 . Среди них роль ММП, NO и воспаления была вовлечена в патофизиологию ревматоидного артрита (РА) и остеоартрита (ОА). Ю и др. 9 показали, что профилактическое введение доксициклина заметно снижает тяжесть ОА у собак. У людей безопасность и эффективность миноциклина оценивали при лечении РА, где двойное слепое рандомизированное многоцентровое исследование показало, что препарат безопасен и эффективен для пациентов с легким и умеренным заболеванием 10 .

PG продуцируются в повышенных количествах в воспаленных тканях, таких как ревматоидный синовиальный слой 11, 12 . PGE 1 и PGE 2 способствуют синовиальному воспалению за счет увеличения местного кровотока и потенцирования эффектов медиаторов, таких как брадикинин, которые индуцируют вазопроницаемость 13 . Было показано, что PGE 2 ингибирует рост хондроцитов, запускает остеокластическую резорбцию кости 14 и активирует продукцию IL-1β 15 , указывая на то, что эта молекула может также способствовать патофизиологии эрозии суставов при артрите.

NO, другой многофункциональный медиатор, продуцируемый различными клетками и воздействующий на них, участвует в разрушении хряща при артрите. Наиболее убедительные доказательства того, что NO является медиатором повреждения тканей, были получены при артрите, основанные на исследованиях, проведенных на животных моделях 16, 17, OA человека 18 и RA 19 .

Мы недавно наблюдали, что хрящ, пораженный OA человека (но не нормальный хрящ) спонтанно высвобождает NO и PGE 2 в условиях ex vivo в количествах, достаточных для того, чтобы вызвать повреждение хряща 18, 20 .Это в первую очередь связано с тем, что хрящ человека, пораженный ОА, демонстрирует повышающую регуляцию пораженных ОА NOS (OA-NOS) и ЦОГ-2.

В связи с виновной ролью NO и ПГЕ 2 в развитии артрита, их деструктивным действием на суставы, включая активацию металлопротеаз 1 , мы оценили действие тетрациклинов на высвобождение ПГЕ 2 из пораженного ОА хряща человека в ex vivo условия 18 и экспрессия ЦОГ-2 в LPS-стимулированных мышиных макрофагах (RAW 264.7).

В настоящем исследовании мы сообщаем, что а) низкие концентрации доксициклина и миноциклина (5–10 мкг/мл) увеличивают накопление PGE 2 в пораженном ОА хряще в условиях ex vivo, независимо от эффектов внутриклеточного NO; б) низкие концентрации l-NMMA (≤100 мкМ) и тетрациклины (20–40 мкг/мл) одинаково ингибируют продукцию NO, но при таких концентрациях только тетрациклины увеличивают продукцию PGE 2 в LPS-стимулированных мышиных макрофагах; c) тетрациклин (40 мкг/мл) и l-NMMA (500 мкМ) дополнительно ингибируют продукцию NO и увеличивают продукцию PGE 2 в RAW 264, стимулированном ЛПС.7 ячеек; и d) доксициклин и миноциклин усиливают экспрессию ЦОГ-2 на уровне мРНК ЦОГ-2 и накопления белка в мышиных макрофагах, стимулированных ЛПС. В совокупности данные показывают, что тетрациклины оказывают независимое и противоположное влияние на регуляцию продукции NO и PGE 2 . Эти наблюдения могут иметь значение при клиническом применении тетрациклинов для лечения артрита.

Материалы и методы

Клеточные линии и реагенты

Мышиные макрофаги (RAW 264.7) были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA). Антимышиные антитела к iNOS и ЦОГ-2 были получены от Transduction Laboratories (Лексингтон, Кентукки). Пораженный ОА хрящ был получен от пациентов с ОА, перенесших операцию по замене коленного сустава и не принимавших стероидные/нестероидные противовоспалительные препараты в течение как минимум 2 недель до операции. Доксициклин, миноциклин, гидрокортизон и ЛПС были получены от Sigma (Сент-Луис, Миссури).

Заготовка бычьих хондроцитов

Бычий хрящ получали от молодых телят.Выделение бычьих хондроцитов из копыт проводили, как описано ранее 21 . Вкратце, нормальный бычий хрящ промывали в RPMI 1640, разрезали на мелкие кусочки и расщепляли ферментами. Кусочки хряща инкубировали с трипсином (0,25%) в RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) в течение 30 мин при 37°C, после чего их промывали и повторно инкубировали в гиалуронидазе (0,2%) и коллагеназе (0,2%), растворенных в RPMI. 1640, содержащем 5% FBS, в течение 16 ч при 37°С при постоянном перемешивании (100 об/мин).Клетки пропускали через нейлоновую сетку 75 мкм и дважды промывали PBS для удаления клеточного дебриса. Высвобожденные клетки суспендировали в RPMI 1640 плюс 10% FBS плюс антибиотики и высевали в 24-луночный планшет (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) при плотности 5×10 5 клеток/2,0 см 2 . Через 48 ч среду меняли и клетки предварительно инкубировали в свежей среде с различными модуляторами перед стимуляцией ЛПС (100 мкг/мл) и анализировали на уровни NO и PGE 2 через 72 ч после стимуляции.

Анализ OA-NOS в органных культурах

Этот анализ был в основном проведен, как описано ранее 18 . Вкратце, хрящ, пораженный ОА, был получен из плато большеберцовой кости и мыщелка бедренной кости у пациентов с ОА, перенесших операцию по замене коленного сустава. Пораженный ОА хрящ разрезали на диски диаметром 3 мм; 4–6 дисков (∼100–200 мг) помещали в органные культуры в 2 мл среды (Ф-12 с 0,1% альбумина человека) на 24–72 ч в инкубаторе. Среду анализировали на накопление нитритов и PGE 2 с помощью модифицированной реакции Грисса 22 и радиоиммуноанализа соответственно 23 .

Приготовление бесклеточных экстрактов

Клетки RAW 264.7 индуцировали LPS (100 нг/мл) в присутствии или в отсутствие тетрациклинов или гидрокортизона в течение 14–20 часов. После индукции клетки осаждали при 4°С и ресуспендировали в Трис-буфере 10 мМ (рН 7,4), содержащем по 10 мкг/мл химостатина, антипаина, лейпептина и пепстатина, 1 мМ ДТТ и 1 мМ ФМСФ. Клетки лизировали в гомогенизаторе Polytron PA 1200 (Kinematica, Швейцария) после 3 циклов быстрого замораживания-оттаивания.Лизат центрифугировали при 18000 об/мин в течение 60 мин при 4°C в центрифуге Eppendorf (Eppendorf, Madison, WI) и растворимый супернатант использовали в качестве бесклеточных экстрактов. Белок измеряли с помощью реагента для анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (Pierce, Rockford, IL) с использованием BSA в качестве стандарта 24 .

Вестерн-блот-анализ

Равные количества белка (25–50 мкг), оцененные с помощью реагента бицинхониновой кислоты (BCA) (Pierce), загружали в гели SDS-PAGE и окрашивали для проверки концентрации различных белковых фракций путем изучения интенсивности белковые полосы на геле.Вестерн-блоттинг исследовали с помощью специфических mAb против iNOS или против COX-2. Блоты были получены с использованием системы вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL). Количественную оценку полос проводили с использованием денситометра (Molecular Dynamics, Sunnyville, CA).

Нозерн-блоттинг

Тотальную РНК выделяли с использованием реагента TRI (MRC, Cincinnati, OH). Нозерн-блот анализ проводили, как описано Черчем и Гилбертом 25 . Вкратце, 20 мкг РНК подвергали электрофорезу в 1% агарозо-формальдегидном геле.Затем гель переносили капиллярным действием на нейлоновую мембрану (zeta Probe, Bio-Rad Laboratories, Melville, NY). Мембрану гибридизовали с [ 32 P]dCTP-меченой кДНК СОХ-2 (любезный подарок доктора Пола Уорли, Университет Джонса Хопкинса) и GAPDH. После гибридизации блот экспонировали на рентгеновскую пленку Kodak (Kodak, Rochester, NY) в течение 24–48 ч с усиливающими экранами при температуре -70°C. Количественную оценку интенсивности полос COX-2/GAPDH проводили с использованием денситометра (Molecular Dynamics).

Статистический анализ

Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение, и статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения GraphPad (V1.14). Тест t или непараметрический тест (критерий Манна-Уитни или Вилкоксона) проводили для экспериментов, как описано в подписях к фигурам.

Результаты

Влияние доксициклина и миноциклина на выработку PGE

2 в хряще человека, пораженного ОА соответственно, в условиях ex vivo 18, 20.В настоящем исследовании мы изучали, может ли доксициклин или миноциклин модулировать опосредованное ЦОГ-2 спонтанное высвобождение PGE 2 человека в этих условиях ex vivo. Для этого исследования были выбраны общепринятые фармакологически значимые концентрации тетрациклинов на основании предыдущих отчетов 2, 26, 27, 28. Срезы хряща, пораженные ОА, инкубировали в среде, не содержащей эндотоксинов, содержащей 0,1% альбумина человека с 5–80 мкг/мл доксициклина и без него, в условиях ex vivo в течение 72 ч (таблица I⇓).Самопроизвольно высвобождаемый PGE 2 и оксид азота (контролируемый путем оценки стабильного конечного продукта, нитрита) исследовали в среде, как описано ранее 20 .

Таблица I.

Регуляция спонтанного высвобождения PGE 2 и NO пораженным ОА хрящом в условиях ex vivo a

Относительно низкие концентрации доксициклина (10–20 мкг/мл) не оказывали существенного влияния на спонтанное накопление нитрита, но вызывали значительное увеличение накопления PGE 2 .Однако добавление 40 мкг/мл доксициклина значительно блокировало накопление нитритов в пораженном ОА хряще в условиях ex vivo, а также вызывало повышенное накопление PGE 2 , как это наблюдалось при 10–20 мкг/мл доксициклина. Доксициклин в дозе 80 мкг/мл приводил к значительному ингибированию накопления нитритов без влияния на спонтанное высвобождение PGE 2 . Эти эксперименты позволяют предположить, что увеличение уровня PGE 2 в хряще, пораженном ОА, под действием доксициклина находится в пределах узкого диапазона, зависящего от концентрации доксициклина.Кроме того, этот эффект доксициклина не зависит от концентрации NO, поскольку а) низкие концентрации тетрациклина (10–20 мкг/мл) увеличивают продукцию PGE 2 , но не оказывают существенного влияния на продукцию NO и б) высокие концентрации тетрациклина (80 мкг/мл). мкг/мл), который ингибирует продукцию NO, не оказывает существенного влияния на продукцию PGE 2 .

Влияние доксициклина и миноциклина на продукцию PGE

2 в хряще, пораженном ОА, в присутствии цитокинов и эндотоксина

наличие цитокинов и эндотоксина (таблица II⇓).Пораженный ОА хрящ при инкубации с цитокинами и эндотоксином показал значительное увеличение накопления NO и PGE 2 .

Таблица II.

Регуляция ПГЕ 2 и оксида нитрита тетрациклинами в пораженном ОА хряще в условиях in vitro в присутствии цитокинов плюс эндотоксин a

Как видно из предыдущих экспериментов, индуцированный цитокинами и эндотоксинами ПГЕ 2 также мог усиливаться низкими концентрациями доксициклина (5–10 мкг/мл), которые не оказывали существенного влияния на уровни NO в среде .Точно так же концентрации доксициклина от 20 до 40 мкг/мл не оказывали существенного влияния на продукцию PGE 2 , но ингибировали продукцию NO. Более того, более высокие концентрации доксициклина (80 мкг/мл) не только значительно ингибировали продукцию NO, но также ингибировали продукцию PGE 2 по сравнению с индуцированной цитокинами и эндотоксинами продукцией PGE 2 .

Мы также проверили влияние другого производного тетрациклина, миноциклина, на высвобождение PGE 2 в присутствии цитокинов и эндотоксина в пораженном ОА хряще.Миноциклин (5 мкг/мл) не оказывал существенного влияния на продукцию NO и (в отличие от доксициклина) не влиял на продукцию PGE 2 . Миноциклин (10 мкг/мл) вызывал значительное увеличение продукции PGE 2 и (как и доксициклин) не оказывал существенного влияния на продукцию NO. Повышение концентрации миноциклина (от 20 до 40 мкг/мл) значительно ингибировало продукцию NO, не влияя на продукцию PGE 2 . Миноциклин (80 мкг/мл) (как и доксициклин в этом эксперименте) ингибировал продукцию как NO, так и PGE 2 .Таким образом, эти два тетрациклина оказывают двухфазное дозозависимое действие на PGE 2 , которое не зависит от их действия на NO.

Влияние ингибитора NOS (l-NMMA) на продукцию PGE

2 в хряще, пораженном ОА

Для дальнейшего изучения роли NO в регуляции PGE 2 конкурентный субстратный ингибитор NOS) добавляли в различных концентрациях (25–500 мкМ) к пораженным ОА хрящевым эксплантатам и оценивали уровни PGE 2 и NO в среде.l-NMMA (50–100 мкМ), ингибирующий накопление NO примерно на 70% и менее, не оказывал существенного влияния на уровни продукции PGE 2 (табл. III⇓). Однако более высокая концентрация l-NMMA (500 мкМ), которая подавляла продукцию NO на ≥85%, вызывала значительное увеличение продукции PGE 2 , как описано ранее 48 . Эти эксперименты показывают, что пороговое ингибирование (≥85% индуцированного LPS) образования NO под действием l-NMMA должно быть достигнуто до того, как будет наблюдаться увеличение PGE 2 (таблица III⇓).Это говорит о том, что низкая концентрация NO достаточна для ингибирования опосредованной ЦОГ-2 продукции PGE 2 . Неспецифические эффекты ингибитора NOS l-NMMA можно исключить, поскольку другие ингибиторы NOS, такие как l- N 5 -(1-иминоэтил)-орнитин · HCL (l-NIO) и l-нитроцитруллин, также ингибируют Продукция NO и увеличение накопления PGE 2 в пораженном ОА хряще (данные не показаны). Эффекты 1-NMMA отличаются от эффектов, наблюдаемых с тетрациклинами, поскольку увеличение продукции PGE 2 может быть достигнуто при концентрациях тетрациклина, которые существенно не ингибируют накопление NO.Эти эксперименты позволяют предположить, что тетрациклины оказывают дифференцированное и независимое воздействие на PGE 2 и продукцию NO.

Таблица III.

Регуляция спонтанного высвобождения PGE 2 и NO пораженным ОА хрящом in vivo в условиях ex vivo в присутствии l-NMMA> a

Влияние доксициклина на NO и PGE

2 в хондроцитах быка, стимулированных ЛПС

Мы проверили влияние доксициклина на хондроциты быка, которые при стимуляции LPS проявляют повышающую регуляцию NO и PGE 2 в течение 72 часов 21 .Первичные бычьи хондроциты, стимулированные ЛПС в присутствии от 1 до 2,5 мкг/мл, не оказывали влияния на накопление NO, но наблюдалось значительное увеличение продукции PGE 2 (таблица IV⇓). Доксициклин в дозе 5 мкг/мл ингибировал продукцию NO и увеличивал накопление PGE 2 , тогда как 10 мкг/мл доксициклина ингибировал продукцию как NO, так и PGE 2 в хондроцитах, стимулированных ЛПС. Эти эксперименты показывают двухфазный эффект доксициклина на продукцию NO и PGE 2 , наблюдаемый в культурах хрящей человека, пораженных OA.

Таблица IV.

Регуляция NO и PGE 2 в бычьих хондроцитах, стимулированных LPS, в присутствии доксициклинов a

Влияние доксициклина и миноциклина на NO и PGE

2 в мышиных макрофагах

На основании вышеуказанных исследований мы стремились оценить механизм действия тетрациклинов на экспрессию ЦОГ-2 в модели мышиных макрофагов по следующим причинам: а) биохимия, энзимология и молекулярная биология iNOS и COX-2 хорошо охарактеризованы в этих клетках 29, 30 ; б) наша неспособность после нескольких попыток точно и воспроизводимо количественно оценить экспрессию ЦОГ-2 непосредственно в хряще, пораженном ОА, без нарушения архитектуры хряща, который играет важную роль в продукции PGE 2 ; и c) регуляция NO и PGE 2 в пораженном OA хряще и LPS-стимулированных мышиных макрофагах, по-видимому, сходна на основании наших и других предыдущих наблюдений 4, 20, 31, 32, 48 .

Клетки RAW 264.7 активировали LPS (100 нг/мл) для индукции iNOS и ЦОГ-2 33 с 20–80 мкг/мл доксициклина и миноциклина и без них. В таблице V⇓ показано зависимое от концентрации ингибирование накопления нитритов в клетках, стимулированных LPS, в присутствии 20–80 мкг/мл доксициклина или миноциклина через 16 ч инкубации, как сообщалось ранее 4 . Доксициклин (20 мкг/мл) ингибировал LPS-стимулированную продукцию NO мышиными макрофагами, но не влиял на продукцию PGE 2 .Напротив, более высокие концентрации доксициклина или миноциклина (40 мкг/мл) как увеличивали PGE 2 , так и ингибировали продукцию NO, результаты сравнимы с результатами, наблюдаемыми в ткани эксплантата ОА. Ингибирование продукции NO с помощью l-NMMA до уровней, сравнимых с уровнями, достигаемыми тетрациклинами при 40 мкг/мл, не влияло на продукцию PGE 2 .

Стол В.

Регуляция NO и PGE 2 в мышиных макрофагах, стимулированных ЛПС в присутствии тетрациклинов a

Регулирование NO и PGE

2 с помощью l-NMMA в мышиных макрофагах

Далее мы проверили влияние l-NMMA на продукцию NO и PGE 2 мышиными макрофагами.Ингибирование iNOS конкурентными ингибиторами NOS (l-NMMA) в низких концентрациях (≤100 мкМ) значительно ингибировало накопление NO (~60%) и не влияло на уровни PGE 2 , тогда как гидрокортизон блокировал оба PGE . 2 и продукции NO (рис. 1⇓). l-NMMA (500 мкМ) ингибировал >90% накопление нитритов и значительно увеличивал продукцию PGE 2 , что согласуется с различными сообщениями в литературе 20, 31, 34 . Эти данные согласуются с данными, полученными с использованием эксплантатов OA, и снова указывают на то, что низкие концентрации NO достаточны для ингибирования COX-2-опосредованной продукции PGE 2 .

ФИГУРА 1.

Влияние l-NMMA на накопление нитритов и производство PGE 2 . Клетки RAW 264.7 стимулировали 100 нг/мл LPS в присутствии и в отсутствие 100 и 500 мкМ 1-NMMA и 10 мкМ гидрокортизона в течение 16 часов. Уровни нитрита и PGE 2 оценивали по среде. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, определенное с помощью теста Стьюдента t ( n = 3). Описанные значения p сравниваются между LPS-стимулированными клетками и экспериментальными: а, ≤ 0.05; б, ≤ 0,01; и с, ≤ 0,0001.

Регуляция NO и PGE

2 с помощью l-NMMA и тетрациклина в мышиных макрофагах 1-NMMA (25–500 мкМ) плюс тетрациклины (40 мкг/мл) (рис. 2⇓). Доксициклин или миноциклин отдельно (40 мкг/мл) увеличивали продукцию PGE 2 с ингибированием продукции NO, подобным тому, что показано на рис.1⇑. Менее 100 мкМ l-NMMA блокировали продукцию NO без значительного влияния на продукцию PGE 2 , а ≥200 мкМ l-NMMA ингибировали продукцию NO и увеличивали продукцию PGE 2 . Комбинация 25–100 мкМ 1-NMMA (которая незначительно увеличивала продукцию PGE 2 ) с 40 мкг/мл тетрациклинов дополнительно увеличивала продукцию PGE 2 . Точно так же снижение накопления нитритов также было аддитивным в присутствии 1-NMMA и тетрациклинов.Следует отметить, что 200–500 мкМ 1-NMMA, концентрации, которые увеличивают продукцию PGE 2 , дополнительно увеличивали продукцию PGE 2 в присутствии тетрациклинов. Эти эксперименты показывают, что механизм ингибирования NOS с помощью l-NMMA 35 и тетрациклинов 4, 36 различен, как и механизм, с помощью которого l-NMMA и тетрациклины увеличивают продукцию PGE 2 .

ФИГУРА 2.

Влияние l-NMMA и тетрациклинов на накопление нитритов и PGE 2 .Клетки RAW 264.7 стимулировали LPS в присутствии различных концентраций 1-NMMA, с 40 мкг/мл доксициклина (Doxy) или миноциклина (Mino) или без них. Уровни NO и PGE 2 оценивали через 16 часов. Данные представляют собой один из двух подобных экспериментов. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). Значения p (для накопления нитрита и PGE 2 ), описанные между LPS-стимулированными клетками и экспериментом, были следующими: а, ≤ 0.1; б, ≤ 0,07; в, ≤ 0,03; г, ≤ 0,02; д, ≤ 0,001; f ≤ 0,0004; и g ≤ 0,0001.

Влияние доксициклина и миноциклина на экспрессию белка СОХ-2 в мышиных макрофагах

Ранее мы сообщали, что тетрациклины ингибируют экспрессию белка iNOS, что подтверждается вестерн-блоттингом, но не оказывает существенного влияния на общую экспрессию белка СОХ-2 4 . Мы 48 и другие 37 показали, что ~90% ЦОГ-2 локализовано во фракции перинуклеарной мембраны. В наших исследованиях с использованием субклеточного фракционирования мы также отметили, что ∼10% или меньшее количество белка ЦОГ-2 локализовано в растворимой цитозольной фракции, которую мы обозначили как цитозольную ЦОГ-2 (Cy-COX-2) 48. .Поскольку тетрациклины не влияли на экспрессию ядерной ЦОГ-2, но наблюдалось увеличение накопления PGE 2 , мы исследовали экспрессию белка Су-ЦОГ-2 в мышиных макрофагах, стимулированных ЛПС в присутствии и отсутствие различных концентраций доксициклина и миноциклина. Цитозольные бесклеточные экстракты готовили, как описано в «Материалы и методы» . Цитозольную фракцию анализировали на 133 кДа iNOS и 72 кДа Cy-COX-2 с помощью вестерн-блоттинга с использованием специфических антител.На рис. 3⇓ показано зависимое от дозы ингибирование экспрессии белка iNOS в присутствии как доксициклина (ингибирование 10–65%), так и миноциклина (ингибирование 13–82%), как наблюдалось ранее 4, и одновременное дозозависимое увеличение Экспрессия Cy-COX-2 доксициклином или миноциклином. Гидрокортизон, как и ожидалось, ингибировал экспрессию как iNOS, так и ЦОГ-2. Не было значительного влияния на уровни синтеза β-актина в тех же образцах (данные не показаны). Эксперименты предполагают, что эффекты доксициклина или миноциклина на iNOS и Cy-COX-2 специфичны, но механизм ингибирования iNOS и усиления Cy-COX-2, по-видимому, различен.

РИСУНОК 3.

Вестерн-блот-анализ iNOS и ЦОГ-2 в клетках RAW 264.7, подвергшихся воздействию доксициклина или миноциклина в присутствии ЛПС. Клетки RAW 264.7 активировали 100 нг/мл LPS в течение 16–18 часов, с доксициклином или миноциклином (20–80 мкг/мл) и без них (20–80 мкг/мл) и гидрокортизоном (10 мкМ), как описано в «Материалы и методы» . Тридцать микрограммов растворимой цитозольной фракции клеточного экстракта наносили на гели SDS-PAGE и затем проводили вестерн-блоттинг. Фильтр исследовали mAb против iNOS и против COX-2.Процентное увеличение сигнала ЦОГ-2 сравнивали с таковым для экстракта, стимулированного ЛПС. Данные представляют собой один из четырех подобных экспериментов.

Влияние доксициклина и миноциклина на экспрессию мРНК ЦОГ-2

Ранее мы сообщали, что тетрациклины подавляют накопление мРНК iNOS, что приводит к ингибированию экспрессии белка iNOS, специфической активности и накоплению нитрита 4, 36 . В текущих исследованиях также был проведен Нозерн-блот-анализ мРНК СОХ-2 (через 4 и 16 часов) для оценки влияния этих агентов на экспрессию СОХ-2.Как показано на рис. 4⇓ и , доксициклин и миноциклин увеличивали накопление мРНК ЦОГ-2 в клетках RAW 264.7, стимулированных LPS, в течение 4 часов. Сходным образом циклогексимид, как описано ранее, также увеличивает накопление мРНК COX-2 в присутствии LPS 38 . Доксициклин/миноциклин и циклогексимид не оказывали аддитивного эффекта на накопление мРНК ЦОГ-2, что указывает на то, что синтез белка de novo не является необходимым условием для накопления мРНК ЦОГ-2 в присутствии ЛПС и тетрациклинов.Гидрокортизон, как и ожидалось, ингибировал накопление мРНК ЦОГ-2.

РИСУНОК 4.

Анализ экспрессии мРНК ЦОГ-2 с помощью нозерн-блоттинга в присутствии и в отсутствие тетрациклинов и ингибиторов NOS. Нозерн-блоттинг экспрессии мРНК ЦОГ-2 и GAPDH в клетках RAW 264.7 проводили после стимуляции ЛПС ± доксициклином или миноциклином, l-NMMA, циклогексимидом (CHX) и гидрокортизоном в течение 4 часов ( a ) или 16 часов ( б ). Тотальную РНК (20 мкг) из клеток подвергали блоттингу для нозерн-блоттинга, а затем исследовали с зондами кДНК СОХ-2 и GAPDH, как описано в Материалы и методы .Сигнал COX-2 и GAPDH определяли и количественно оценивали с использованием денситометра. Процентную модуляцию экспрессии ЦОГ-2 нормализовали по сигналу GAPDH и сравнивали с препаратом мРНК, стимулированным ЛПС. Данные представляют собой один из двух подобных экспериментов.

Мы исследовали влияние тетрациклинов на накопление мРНК ЦОГ-2 через 16 ч после стимуляции. Эти эксперименты также показали, что 40 мкг/мл доксициклина и миноциклина значительно увеличивали накопление мРНК ЦОГ-2 более чем на 150% по сравнению с клетками, стимулированными ЛПС, тогда как гидрокортизон (10 мкМ), как и ожидалось, ингибировал накопление мРНК ЦОГ-2. Инжир.4⇑ б ). l-NMMA в концентрациях (75–150 мкМ), ингибирующих продукцию NO на 60–80%, не оказывал существенного влияния на накопление мРНК ЦОГ-2. l-NMMA в концентрации 500 мкМ, который ингибирует продукцию NO более чем на 90% и увеличивает продукцию PGE 2 в один-два раза, также не оказывает существенного влияния на накопление мРНК COX-2 48 . Эти эксперименты показывают, что (в отличие от l-NMMA) действие доксициклина и миноциклина на ЦОГ-2 находится на уровне накопления мРНК ЦОГ-2. Это может быть связано с повышенной транскрипцией или посттранскрипционной модификацией (или и тем, и другим) мРНК ЦОГ-2.

Обсуждение

Наши исследования показывают, что тетрациклин, доксициклин и миноциклин обладают общим свойством а) ингибировать экспрессию iNOS 4, 36 и б) увеличивать продукцию растворимых ЦОГ-2 и ПГЕ 2 независимо от эффектов внутриклеточного NO. Этот вывод подтверждается наблюдением, что тетрациклины стимулируют мРНК ЦОГ-2, цитозольную экспрессию белка ЦОГ-2 и продукцию PGE 2 в концентрациях, которые не оказывают существенного влияния на продукцию NO. Кроме того, аддитивный эффект тетрациклинов и l-NMMA (в отношении ингибирования NO и увеличения PGE 2 ) согласуется с независимыми механизмами действия тетрациклинов.

Предыдущие исследования показали, что ингибирование NO конкурентными ингибиторами NOS усиливает PGE 2 NO-зависимым образом 31, 32, 34, 39 . Одним из важных наблюдений было требование порогового уровня ингибирования NO с помощью l-NMMA, прежде чем можно будет наблюдать увеличение PGE 2 в пораженных ОА хрящах и мышиных макрофагах. Эти наблюдения показывают, что низкие концентрации внутриклеточного NO достаточны для ингибирования опосредованной ЦОГ-2 продукции PGE 2 .Кроме того, неспецифические эффекты l-NMMA в высоких концентрациях могут быть исключены, поскольку другие ингибиторы NOS, такие как l- N 6 -(1-иминоэтил)-лизин · HCl (l-NIL), l- N 5 -(1-иминоэтил)-орнитин · HCL (l-NIO) и нитроцитруллин не только ингибируют накопление нитрита в пораженном ОА хряще и стимулированных ЛПС мышиных макрофагах, но также значительно увеличивают накопление PGE 2 . Механизм, с помощью которого тетрациклины модулируют iNOS или ЦОГ-2, по-видимому, находится на уровне их соответствующего накопления мРНК.Наши недавние эксперименты показывают, что снижение iNOS мРНК под действием тетрациклинов в первую очередь связано с усилением деградации мРНК iNOS, а не с транскрипцией гена iNOS 36 . Механизм, с помощью которого мРНК ЦОГ-2 активируется, нуждается в выяснении. Однако можно предположить, что один (или оба) из механизмов, описанных ниже, могут действовать: а) COX-2 является ранним геном, который не требует синтеза белка de novo для транскрипции 40 . Следовательно, как и циклогексимид, лечение тетрациклином может преимущественно приводить к накоплению нечувствительной мРНК de novo на ранней стадии; или б) накопление мРНК ЦОГ-2 тетрациклинами через 16 ч может быть связано со стабилизацией мРНК ЦОГ-2.

Наши данные, объединенные с предыдущими выводами других исследователей, показывают, что тетрациклины проявляют плейотропные функции независимо от их антимикробной активности, которая включает ингибирование MMPs 2 , экспрессию NOS 4 , прогрессирование опухоли, резорбцию кости 5, 6 , ангиогенез 7 и воспаление 8. Мы предполагаем, что плейотропные свойства тетрациклинов могут быть частично связаны с их способностью воздействовать на другие многофункциональные сигнальные молекулы, такие как PGE 2 и NO.Известно, что PGE 2 при сверхпродукции в клетках оказывает разнообразное воздействие на клеточные функции, включая активацию MMPs 41 , индукцию или защиту апоптоза в зависимости от типа клеток 42, 43 , стимулирование метастатического роста опухоли 44, 45 , ингибирование пролиферации хондроцитов 46 и повышающая регуляция транскрипции IL-1 и уровней цАМФ в различных типах клеток 15, 47 . Наши исследования показывают, что немикробные действия тетрациклинов сложны, что подчеркивает их потенциальную роль в качестве обоюдоострого меча, который по-разному регулирует два плейотропных медиатора: NO и PGE 2 .

Принимая во внимание настоящее использование доксициклина и миноциклина в клинических испытаниях при РА и склеродермии, результаты предполагают осторожность при использовании тетрациклинов в качестве противовоспалительных препаратов в текущих клинических испытаниях.

Благодарности

Мы благодарим доктора Пола Уорли за щедрое предоставление кДНК ЦОГ-2 и Уну Йервуд для подготовки рукописи.

Сноски

  • ↵1 Первые два автора внесли равный вклад.

  • ↵2 Корреспонденцию и запросы на перепечатку адресовать Dr.Ашок Р. Амин, отделение ревматологии, кабинет 1600, больница заболеваний суставов, 301 East 27th Street, New York, NY 10003. Адрес электронной почты: amina01{at}mcrcr6.med.nyu.edu

  • ↵3 Сокращения, использованные в данной статье: ММП, матриксная металлопротеиназа; NO, оксид азота; NOS, NO-синтаза; iNOS, индуцируемая NOS; ecNOS, эндотелиальная NOS; OA-NOS, пораженный остеоартритом NOS; 1-NMMA, 1- N -монометиларгинин; ЦОГ, циклооксигеназа; Cy-COX-2, цитозольная COX-2; РА, ревматоидный артрит; GAPDH, глицеральдегидфосфатдегидрогеназа.

  • Поступила 20 июля 1998
  • Принято 9 декабря 1998 г.
  • Все права защищены © 1999 Американской ассоциации иммунологов

Ссылки

  1. Голуб, Л. М., Н. С. Рамамурти, Т. Ф. Макнамара, Р. А. Гринвальд, Б. Рифкин. 1991. Тетрациклины ингибируют распад соединительной ткани: новые терапевтические возможности старого семейства препаратов. крит. Преподобный Орал Биол. Мед. 2: 297

  2. Гринвальд, Р.А., Голуб Л.М. 1994. Ингибирование матриксных металлопротеиназ: терапевтический потенциал. Летопись NY Acad. науч. 732: 181

  3. Уитто, В. Дж., Дж. Д. Ферт, Л. Нип, Л. М. Голуб. 1994. Доксициклин и химически модифицированные тетрациклины ингибируют экспрессию гена желатиназы А (ММР-2) в кератиноцитах кожи человека. Анна. Академик Нью-Йорка науч. 732: 140

  4. Амин, А. Р., М. Г. Аттур, Г. Д. Таккер, П. Д. Патель, П. Вьяс, Р. Н. Патель, И. Р.Патель, С. Б. Абрамсон. 1996. Новый механизм действия тетрациклинов: воздействие на синтазы оксида азота. проц. Натл. акад. науч. США 93: 14014

  5. ДеКлерк, Ю. А., Х. Шимада, С. М. Тейлор, К. Э. Лэнгли. 1994. Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при опухолевой прогрессии. Анна. Академик Нью-Йорка науч. 732: 222

  6. Рифкин Б., А. Т. Вернилло, Л. М. Голуб, Н. С. Рамамурти. 1994. Модуляция резорбции костей тетрациклинами.Анна. Академик Нью-Йорка науч. 732: 165

  7. Марагудакис, М. Э., П. Перистерис, Э. Миссирлис, А. Алетрас, П. Андриопулу, Г. Харалабопулос. 1994. Ингибирование ангиогенеза антрациклинами и дихлоридом титаноцена. Анна. Академик Нью-Йорка науч. 732: 280

  8. Ramamurthy, N.S., R.A. Greenwald, S.A. Moak, J. Scuibba, A. Goren, G. Turner, B. Rifkin, L.M. Golub. 1994. Лечение СМТ/тенидапом ингибирует разрушение височно-нижнечелюстного сустава у крыс с адъювантным артритом.Анна. Академик Нью-Йорка науч. 732: 427

  9. Ю, Л. П., Г. Н. Смит, К. Д. Брандт, С. Л. Майерс, Б. Л. О’Коннор, Д. А. Брандт. 1992. Уменьшение тяжести остеоартрита у собак путем профилактического лечения пероральным доксициклином. Ревмирующий артрит. 35: 1150

  10. О’Делл, Дж. Р., К. Э. Хайр, В. Палмер, В. Дримальски, С. Уиз, К. Блейкли, М. Черчилль, П. Дж. Экхофф, А. Уивер, Д. Доуд, и др. 1997. Лечение раннего ревматоидного артрита миноциклином или плацебо: результаты рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования.Ревмирующий артрит. 40: 842

  11. Бомбардье, С., П. Каттани, Г. Джабаттони, О. Ди Мунно, Г. Паэро, К. Патроно, Э. Пинка, Ф. Пульезе. 1981. Синовиальная система простагландинов при хроническом воспалительном артрите: дифференциальные эффекты стероидных и нестероидных противовоспалительных препаратов. бр. Дж. Фармакол. 73: 893

  12. Дэвис, П., П. Дж. Бейли, М. М. Голденберг, А. В. Форд-Хатчинсон. 1984. Роль продуктов оксигенации арахидоновой кислоты в боли и воспалении.Анну. Преподобный Иммунол. 2: 335

  13. Дэвис, П., Д. Э. Макинтайр. 1992. Простагландины и воспаление. Дж. И. Галлин, И. М. Гольдштейн и Р. Снайдерман, ред. Воспаление: основные принципы и клинические корреляты 123-138. Рейвен Пресс, Нью-Йорк.

  14. Робинсон, Д. Р., А. Х. Ташджян, Л. Левин. 1975. Стимулируемая простагландинами резорбция кости ревматоидной синовией: возможный механизм разрушения костей при ревматоидном артрите.Дж. Клин. Инвестировать. 56: 1181

  15. Охмори Ю., Г. Страссман, Т. А. Гамильтон. 1990. цАМФ по-разному регулирует экспрессию мРНК, кодирующей IL-1α и IL-1β, в мышиных перитонеальных макрофагах. Дж. Иммунол. 145: 3333

  16. Маккартни-Фрэнсис, Н., Дж. Б. Аллен, Д. Э. Мизель, Дж. Э. Альбина, К. В. Се, К. Натан, С. М. Вал. 1993. Подавление артрита ингибитором синтазы оксида азота. Дж. Эксп. Мед. 178: 749

  17. Стефанович-Рацич, М., К. Мейерс, К. Мештер, Дж. В. Коффи, Р. А. Хоффман, Ч. Х. Эванс. 1994. N-монометиларгинин, ингибитор синтазы оксида азота, подавляет развитие адъювантного артрита у крыс. Ревматоидный артрит. 37: 1062

  18. Амин А. Р., П. Ди Чезаре, П. Вьяс, М. Г. Аттур, Э. Ценг, Т. Р. Биллиар, С. А. Стучин, С. Б. Абрамсон. 1995. Экспрессия и регуляция синтазы оксида азота в хондроцитах человека, пораженных остеоартритом: свидетельство повышенной активности нейрональной синтазы оксида азота.Дж. Эксп. Мед. 182: 2097

  19. Сакураи Х., Х. Косака, М. Ф. Лю, Х. Хигасияма, Ю. Хирата, К. Канно, И. Сайто, Н. Миясака. 1995. Производство оксида азота и индуцируемая экспрессия синтазы оксида азота при воспалительных артритах. Дж. Клин. Инвестировать. 96: 2357

  20. Амин, А. Р., М. Г. Аттур, Р. Н. Патель, Г. Д. Таккер, П. Дж. Маршалл, Дж. Редиске, С. Б. Абрамсон. 1997. Супериндукция активности циклооксигеназы-2 в пораженном остеоартритом хряще человека.Дж. Клин. Инвестировать. 99: 1231

  21. Аттур, М. Г., Р. Н. Патель, П. Ди Чезаре, Г. Штайнер, С. Б. Абрамсон, А. Р. Амин. 1998. Регуляция продукции оксида азота салицилатами и тенидапом в хрящах, пораженных ОА человека, хондросаркомах крыс и хондроцитах крупного рогатого скота. Osteoarthritis Cartilage 6: 269

  22. Gilliam, M.B., M.P. Sherman, JM Griscavage, L.J. Ignarro. 1993. Спектрофотометрический анализ нитратов с использованием окисления НАДФН нитратредуктазой Aspergillus .Анальный. Биохим. 212: 359

  23. Аттур, М. Г., И. Р. Патель, Р. Н. Патель, С. Б. Абрамсон, А. Р. Амин. 1998. Аутокринная продукция IL-1B человеческим хрящом, пораженным остеоартритом, и дифференциальная регуляция эндогенного оксида азота, IL-6, простагландина E 2 и IL-8. проц. доц. Являюсь. Physicians 110: 1

  24. Smith, P.K., R.I. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D. Provenzano, E.K.Фудзимото, Н. М. Гёке, Б. Дж. Олсон, Д. К. Кленк. 1985. Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Анальный. Биохим. 150: 76

  25. Черч, Г. М., В. Гилберт. 1984. Геномное секвенирование. проц. Натл. акад. науч. USA 81: 1991

  26. Yu, L.P., G.N. Smith, K.A. Hasty, and K.D. Brandt. Доксициклин ингибирует коллагенолитическую активность XI типа экстрактов остеоартритного хряща человека и желатиназы. Дж. Реум. 18:1450.

  27. Коул А.А., Чубинская С., Члебек К., Орт М.В., Лучене Л.Л., Шмид Т.М. 1994. Ингибирование доксициклином деградации хрящевого матрикса. Анна. Академик Нью-Йорка науч. 732: 414

  28. Малья, С. К., Дж. Э. Холл, Х. М. Ли, Э. Дж. Ремер, С. Р. Саймон, Л. М. Голуб. 1994. Взаимодействие матриксных металлопротеиназ с ингибиторами сериновых протеаз: новые потенциальные роли ингибиторов матриксных металлопротеиназ. Анна. Академик Нью-Йорканауч. 732: 303

  29. Натан К. и К.-В. Се. Регуляция биосинтеза оксида азота. Дж. Биол. хим. 269:13725.

  30. Wu, KK. 1995. Индуцибельная циклооксигеназа и синтаза оксида азота. Доп. Фармакол. 33: 179

  31. Хабиб, А., К. Бернар, М. Лебре, К. Кременон, Б. Эспозито, А. Тедги, Дж. Маклуф. 1997. Регуляция экспрессии циклооксигеназы-2 оксидом азота в перитонеальных макрофагах крыс.Дж. Иммунол. 158: 3845

  32. Сверкош, Т. А., Дж. Митчелл, Т. Д. Уорнер, Р. М. Боттинг, Дж. Р. Вейн. 1995. Коиндукция синтазы оксида азота и циклооксигеназы: взаимодействие между оксидом азота и простаноидами. бр. Дж. Фармакол. 114: 1335

  33. Амин, А. Р., П. Вяс, М. Г. Аттур, Дж. Лещинска-Пизяк, И. Р. Патель, Г. Вайсман, С. Б. Абрамсон. 1995. Механизм действия аспириноподобных препаратов: влияние на индуцибельную синтазу оксида азота.проц. Натл. акад. науч. USA 92: 7926

  34. Stadler, J., B.G. Harbrecht, M. Di Silvio, R.D. Curran, M.L. Jordan, R.L. Simmons, T.R. Billiar. 1997. Эндогенный оксид азота ингибирует синтез продуктов циклооксигеназы и интерлейкина-6 клетками Купфера крыс. J. Биол. лейкоцитов. 53: 165

  35. Рейф, Д. В., С. А. Маккриди. 1995. N -нитро-1-аргинин и N -монометил-1-аргинин проявляют разный характер инактивации трех синтаз оксида азота.Арка Биохим. Биофиз. 320: 170

  36. Амин, А. Р., Р. Н. Патель, Г. Д. Таккер, К. Дж. Ловенштейн, М. Г. Аттур, С. Б. Абрамсон. 1997. Посттранскрипционная регуляция мРНК индуцируемой синтазы оксида азота в мышиных макрофагах доксициклинами и химически модифицированными тетрациклинами. ФЭБС лат. 410: 259

  37. Смит, В. Л., Р. М. Гаравито, Д. Л. ДеВитт. 1996. Простагландинэндопероксид H-синтазы (циклооксигеназы)-1 и -2.Дж. Биол. хим. 52: 33157

  38. Ньютон Р., Д. А. Стивенс, Л. А. Харт, М. Линдсей, И. М. Адкок, П. Дж. Барнс. 1997. Супериндукция мРНК ЦОГ-2 циклогексимидом и интерлейкином-1β включает усиление транскрипции и коррелирует с повышенной активацией NF-κB и JNK. ФЭБС лат. 418: 135

  39. Henrotin, YE., S.X. Zheng, G.P. Deby, A.H. Labasse, JM Crielaard, JY Reginster. 1998. Оксид азота подавляет продукцию интерлейкина 1β (IL-1β), стимулированную IL-6, IL-8 и простагландином E2 хондроцитами человека.Дж. Ревматол. 25: 1595

  40. Рисек, Р. П., К. Райношек, Х. Макдональд-Браво, К. Дорфман, М. Г. Маттеи, Р. Браво. 1992. Идентификация непосредственно раннего гена pgh-B, белковый продукт которого обладает активностью простагландинсинтазы/циклооксигеназы. Рост клеток отличается. 3: 443

  41. Линдси, Дж. Д., К. Кашиваги, Д. Бойл, Ф. Кашиваги, Г. С. Файрштейн, Р. Н. Вайнреб. 1996. Простагландины увеличивают секрецию proMMP-1 и proMMP-3 клетками гладкой мускулатуры ресничек человека.Курс. Глаз Res. 15: 869

  42. Нарко, К., А. Ристимяки, М. Макфи, Э. Смит, К.С. Хауденшильд, Т. Хла. 1997. Онкогенная трансформация иммортализованных эндотелиальных клеток ECV с помощью сверхэкспрессии циклооксигеназы-1. Дж. Биол. хим. 272: 21455

  43. Цудзи М., Р. Н. Дюбуа. 1995. Изменения клеточной адгезии и апоптоза в эпителиальных клетках, сверхэкспрессирующих простагландинэндопероксидсинтазу 2. Клетка 83: 493

  44. Tsujii, M., С. Кавано, Р. Н. Дюбуа. 1997. Экспрессия циклооксигеназы-2 в клетках рака толстой кишки человека увеличивает метастатический потенциал. проц. Натл. акад. науч. США 94: 3336

  45. Boolbol, S.K., A.J. Dannenberg, A. Chadburn, C. Martucci, X.J. Cuo, J.T. Ramonetti, M. Abreu-Goris, H.L. Newmark, M.L. Lipkin, J.J.M.DeCosse, Mlli J.M.DeCosse 1996. Сверхэкспрессия циклооксигеназы-2 и образование опухоли блокируются сулиндаком в мышиной модели семейного аденоматозного полипоза.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.