Ресанта асн 8000 1 ц схема: Стабилизатор напряжения Ресанта АСН-8000 1-Ц схема

Содержание

Заказывайте Стабилизатор напряжения Ресанта АСН 8000/1 Ц по доступным ценам, 49615332

Надежный стабилизатор напряжения Ресанта АСН 8000/1 Ц

 

Данную категорию устройств принято задействовать с целью получения постоянства напряжения в сети. Среди всех предложенных на рынке вариантов наиболее привлекательным выглядят модели от бренда «Ресанта». Они характеризуются надежностью, долговечностью и стабильностью характеристик. Сегодня мы рады предложить вам стабилизатор напряжения Ресанта АСН 8000/1 Ц!

Основные особенности товара

 

 

Другие особенности

 

1

Прибор имеет компактные размеры — 220x230x385 мм и небольшую массу — 16 кг.

2

Для визуализации информации был установлен LCD дисплей.

3

Предоставляется гарантия от производителя сроком на 12 месяцев.

4

КПД стабилизатора — 97%.

 

Для того, чтобы сделать заказ на стабилизатор напряжения Ресанта АСН 8000/1 Ц свяжитесь с нашим менеджером!

 

Схема заказа Стабилизатора напряжения Ресанта АСН 8000/1 Ц

 

Оформить заказ на сайте или по телефону

Консультация менеджера и согласование всех нюансов

Оплата удобным способом

Доставка выбранным способом

Дополнительные характеристики
Товар сертифицированДа
Гарантия1 год
Вес в упаковке14.26 кг
Вес без упаковки13.08 кг
Страна производстваКитай
Габариты, см38,5 х 23 х 22
Страна брендаЛатвия
КомплектацияСтабилизатор напряжения РЕСАНТА
Инструкция
Упаковка
Технические характеристики
ТипРелейный
Мощность8000 Вт
Напряжение сети220 В
Тип входного напряженияОднофазный (220 В)
РазмещениеНапольное
ОхлаждениеПринудительное
Класс защитыIP20
ПитаниеОт электросети
Выходное напряжение202 — 238 В
Габариты, см38,5 х 23 х 22
Высоковольтная защита240 — 250 В
Вес без упаковки13.08 кг
Страна брендаЛатвия
Точность стабилизации8 %
Скорость стабилизации35 В/с
Частота50 Гц
Рабочая температура0 — 45 °C
Возможностицифровая индикация (вольтметр отображает входное и выходное напряжения)
КПД97 %
Страна производстваКитай
Влажность воздуха80 %
Штрихкод EAN-134607076037693
Входное напряжение140 — 260 В
Максимальный потребляемый ток
42.1 А
СерияАСН
КомплектацияСтабилизатор напряжения РЕСАНТА
Инструкция
Упаковка
Штрихкод GTIN04607076037693
Время отклика7 мс
Защитаот короткого замыкания, от перегрева, от повышенного напряжения, от помех
Вес в упаковке14.26 кг

Купить

Однофазный релейный стабилизатор напряжения Ресанта АСН LUX 8000 Н/1-Ц

Вид стабилизатора релейный
Полная мощность, ВА 8000
Активная мощность, кВт 5,6
Точность стабилизации, % 8
Температура эксплуатации, ˚С +5…+40
Рабочий диапазон входного напряжения, В 140…260
Предельный диапазон входного напряжения, В 135…265
Способ установки навесной
Наличие байпаса есть
Способ подключения клемная колодка
КПД, % 97
Индикация Входное напряжение, Выходное напряжение, Уровень нагрузки
Скорость переключения, мс
Способ охлаждения воздушное или принудительное (кулер)
Защита от повышенного напряжения, откл. при ≥ 265 В
Защита от пониженного напряжения, откл. при ≤ 135 В
Защита от перегрузки по току автоматический выключатель
Габариты, мм 305х360х190
Вес, кг 16,6
Гарантия 1 год
Производитель Китай

Стабилизатор Ресанта АСН 8000 Н/1-Ц Lux Цена: 99000 KZT — BigFootTrade

Настенный электронный стабилизатор 8 кВт

Стабилизатор напряжения РЕСАНТА SDR-8000/1 Lux
с возможностью настенного монтажа. Более совершенный и современный дизайн стабилизаторов впишется в Ваш дом и станет надежным защитником техники при имеющемся напряжении в электросети.

Схема стабилизатора основана на коммутации отводов автотрансформатора с помощью ключей. Электронный (релейный) стабилизатор оснащен микропроцессорным управлением и оборудован цифровым дисплеем, отображающим входное/выходное напряжение.

Характеристики:

МодельАСН 8000 Н/1-Ц Lux
Входное напряжение140-260 В
Выходное напряжение220±8% В
Мощность при Uвх≥190 В8 кВт
Рабочая частота50/60 Гц
КПД, при нагрузке 80% не менее97
Точность поддержания выходного напряжения2 %
Время регулирования5-7 мс
Искажение синусоиды
отсутствует
Высоковольтная защита260±5 В
Класс защитыIP 20
Габаритные размеры, Д×Ш×В305х190х360 мм
Масса нетто15 кг

Аналогичный по мощности стабилизатор: Ресанта SDR 8000/1
Рекомендуем ознакомиться со статьей «Как выбрать стабилизатор напряжения»

Опосредованный p53 контроль аспартатно-аспарагинового гомеостаза определяет активность LKB1 и модулирует выживаемость клеток p21 (BD Biosciences, 556431), p53 (DO-1)-HRP (Santa Cruz, sc126-HRP), p53 (Pab 1801) (Santa Cruz, sc-98), фосфорилированный-p53 (Ser15) (технология клеточной сигнализации, 9284S), MDM2(SMP14) (Санта-Крус, sc965), AMPK (технология клеточной сигнализации, 23A3), фосфо-AMPK(Thr 172) (технология клеточной сигнализации, 40H9), ацетил-КоА-карбоксилаза (технология клеточной сигнализации, C83B10), Фосфо-ацетил-КоА-карбоксилаза (Ser79) (технология клеточной сигнализации, 3661), LKB1 (технология клеточной сигнализации, 27D10), фосфо-(Ser/Thr) Phe (технология клеточной сигнализации, 9631), HA(HA-7) (Sigma h4663), FLAG(M2) (Sigma F3165), Actin (Proteintech, 66009-1-LG), козий антикроличий IgG-HRP (Санта-Крус, sc-2004) и козий антимышиный IgG-HRP (Санта-Крус, СК-2302) , антитело ULK1 [EPR4885(2)] (Abcam, ab128859), Phospho-ULK1 (Ser555) (D1h5) (технология клеточной сигнализации, 5869), туберин/TSC2 (технология клеточной сигнализации, 3612), фосфо-туберин/TSC2 (Ser1387 ) (Cell signaling technology, 5584), ATM [2C1 (1A1)] (Abcam, ab78), фосфо-ATM (S1981) [EP1890Y] (Abcam, ab81292), Chk1 (Abcam, ab47574), Phospho-Chk1 (Ser345) (Технология клеточной сигнализации, 2341), киназа p70 S6 (49D7) (технология клеточной сигнализации, 2708), фосфо-p70 S6 киназа (Thr389) (108D2) (технология клеточной сигнализации, 9234).Реагенты были приобретены из следующих источников соответственно: нутлин-3α (Sigma, SML0580), доксорубицин (Sigma, D1515), этопсид (Sigma, E1383), моногидрат l-аспарагина (Sigma, A8381), l-аспарагиновая кислота (Sigma, A9256), l-глутаминовая кислота (Sigma, G1251), l-аспарагин-(

амид 15 N) моногидрат (Sigma, 485896). Аффинный гель ANTI-FLAG M2 (Sigma, A2220), пептид FLAG (Sigma , F3290), пептид HA (Sino Biological, PP100028-1), йодид пропидия (Sigma, P4170), магнитные шарики против HA (Pierce, 88837), агароза белка A/G (Pierce, 20421), мононатриевая соль D-люциферина (Pierce, 88291), л-аспарагиназа (ProSpec, ENZ-287), л-альбиззин (Goldbio, A-230-250), 0.4% раствор трипанового синего (Amresco, K940). Липофектамин 2000 (ThermoFisher Scientific, 12566014), агент трансфекции RNAiMAX (ThermoFisher Scientific, 13778075). Кристаллический фиолетовый (Solarbio, C8470-25).

Плазмиды

Кодирующие последовательности, соответствующие полноразмерным человеческим ASNS , p53 , AMPKα , LKB1 и MBP библиотеки цепной реакции клеток 23DPCRase и амплифицировали с помощью цепной реакции клеток 23DPCRase затем клонировали в пустой вектор pRK5, помеченный эпитопом Flag или HA, как указано.Последовательности клонирования следующие: Человек ASNS : F: 5′-ACGCGTCGACATGTGTGGCATTTGGGC-3′; R: 5′-AACTGCAGCTAAGCTTTGACAGCTGACTTGTAGTGGG-3′. Человеческий p53 : F: 5′-GCTCTAGAATGGAGGAGCCGCAGTCA-3′; R: 5′ CGCTCGAGTCAGTCTGAGTCAGGCCC-3′. Человеческий AMPKα : F: 5′-GCTCTAGAATGCGCAGACTCAGTTCCTG-3′; R: 5′-CCGCTCGAGTTATTGTGCAAGAATTTTAATTAGA-3′. Человеческий LKB1 : F: 5′-ACGCGTCGACATGGAGGTGGTGGACCCG-3′; R: 5′-CCCAAGCTTTCACTGCTGCTTGCAGGC-3′. Человеческий MBP : F: 5′-ACCGGTCGACATGGCGTCACAGAAGAGACC-3′; R: 5′-CCCAAGCTTTTCAGCGTCTAGCCATGGGTG-3′.Полноразмерную люциферазу амплифицировали с помощью ПЦР из вектора pGL3-Basic (Promega, E1751) с использованием следующих последовательностей: F: 5′-CCGCTCGAGATGGAAGACGCCAAAAACAT-3′; R: 5′-CGACGCGTTTACACGGCGATCTTTCCG-3′. Затем продукт ПЦР клонировали в вектор MSCV-IRES-EGFP (плазмида Addgene 20672) для конструирования плазмиды MSCV-Luciferase-IRES-GFP. Все амплификации были выполнены с помощью ПЦР и подтверждены секвенированием ДНК.

Культура клеток и нокдаун генов с помощью кшРНК и киРНК

Все клетки культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 (ThermoFisher Scientific, США) при 37 °C.Клеточные линии 293T, HCT116, U2OS, A549, DU145, A431, MEF, L5178Y, EL4 и NCM460 обычно поддерживали в стандартной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (ThermoFisher Scientific, C11995500BT) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (ThermoFisher Научный, 16000044). Клетки L1210 культивировали в DMEM (ThermoFisher Scientific, C11995500BT) с 10% лошадиной сывороткой (HS) (ThermoFisher Scientific, 16050122). Клетки HEK293, HepG2 и WI-38 культивировали в минимально необходимой среде (MEM) (Corning, 10-010-CVR) с 10% FBS (ThermoFisher Scientific, 16000044).Клетки Jurkat, U937, MOLT4, K652, h2299 и LNCaP культивировали в стандартной среде RPMI-1640 (ThermoFisher Scientific, 11875093) с 10% FBS (ThermoFisher Scientific, 16000044), если не указано иное. Все клетки культивировали без добавления пенициллина-стрептомицина и исследовали на наличие микоплазменной контаминации и культивировали не более 2 месяцев подряд. Их морфология периодически подтверждалась, чтобы избежать перекрестного загрязнения или неправильного использования клеточных линий. Ни одна из клеточных линий, использованных в этом исследовании, не была указана в базе данных ICLAC.

shRNA-опосредованный нокдаун ASNS осуществляли с использованием специфической нацеливающей последовательности shASNS#6 (5′-CCGGGCTCTGTTACAATGGTGAAATCTCGAGATTTCACCATTGTAACAGAGCTTTTTG-3′) или shASNS#10 (5′-CCGGGCTGTATGTTCAGAAGCTAAACTCGAGTTTAGCTTCTGAACATACAGCTTTTTG-3′). В качестве контроля использовали неспецифическую «зашифрованную» последовательность кшРНК (5′-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTT-3′). Эти последовательности были индивидуально клонированы в вектор pLKO.1-puro (Sigma, SHC201), который затем совместно трансфицировали векторами экспрессии, содержащими гены gag/pol, rev и vsvg, в клетки 293T.Лентивирус собирали через 48 ч после трансфекции и обогащали концентрированным раствором лентивируса (GeneCopoeia, LPR-LCS-01) в течение 48 ч при 4°С, после чего добавляли к почти конфлюэнтным клеткам HCT116 с 4 мкг/мл полибрена и культивировали в течение 16 ч. -24 часа до полного заражения. Действительно стабильные трансфицированные клетки отбирали под давлением 2 мкг/мл пуромицина в течение 1–2 недель.

SIRNA-опосредованного NOCKWORD было проведено с липофтектамин Rnaimax трансфекционного агента (ThermOfisher Sciential, 13778075) и сирнас, ориентированные на человека TP53 , ASN , AMPKα , LKB1 и мышь ASNS , индивидуально или объединены для целей эксперимента.Целевые последовательности были следующими: человека TP53 : 5′-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3′, человека ASNS 5′-TGTATGTTCAGAAGCTAAA-3′. Человеческий AMPKα 5′-ACCAUGAUUGAUGAUGAAGCCUUAAAAAAAUUGAUGAUGAAGCCUUAAAAAA-3 ‘, Человеческий LKB1 5′- GGAcugacguguagaacaAtt-3′, Человеческий P21 5′- Cuucgacuuugaccgag-3 ‘, Человеческий ATF4 5′-Caagcacttcaacctcat-3′ 5 , Человек p73 5′-GAGCUCGGGAGG GACUUCAACGAAG-3′, Человек p63 5′-GCACACAAUUGAAACGUACAGGCAA-3′, Человек ATM 5′-CGTGTCTTAATGAGACT-GACCUA-3′, и Мышь asns 5AAGATGACCUA-3′ и Мышь asns

GCAA .Последовательность миРНК (5′-CGUACGCGGAAUACUUCGATT-3′), нацеленная на люциферазу, использовалась в качестве контроля на протяжении всего этого исследования. Все миРНК использовали в концентрации 20 нМ. Для экспериментов по совместной трансфекции общую концентрацию миРНК при всех условиях уравнивали с контрольной миРНК. Процедуры трансфекции миРНК выполняли в соответствии с инструкциями производителя.

Полуколичественная ОТ-ПЦР и количественная ОТ-ПЦР

Вкратце, тотальную РНК выделяли из трех лунок в каждом состоянии с использованием набора для очистки общей РНК (GeneMark, TR01), и 2 мкг РНК каждого образца комплементарно превращали в кДНК с помощью Система синтеза кДНК первой цепи (Thermo Scientific, K1621).0,04 мкг продукта кДНК каждого образца использовали в качестве матрицы для проведения полуколичественной или количественной ПЦР. Пары праймеров, использованные в этом исследовании, включают: Human ASNS : F: 5′-GGAAGACAGCCCCGATTTACT-3; R: 5′-AGCACGAACTGTTGTAATGTCA-3′. Мышь Asns : F: 5′-GCAGTGTCTGAGTGCGATGAA-3′; R: 5′-TCTTATCGGCTGCATTCCAAAC-3′. Человек MDM2 : F: 5′-ATGGTGAGGAGCAGGC-3′; R: 5′-CTAGATGAGGTAGATGGTC-3′. Человек TP53 : F: 5′-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3′; R: 5′-GGCATTCTGGGAGCTTCATC-3′.Человеческий ACTB : F: 5′-GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT-3′; R: 5′-GTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGG-3′. Мышь Actb : F: 5′-ACTACATTCAATTCCATC-3′; R: 5′-CTAGAAGCACTTGCGGTG-3′. Человеческий p21 : F: 5′-CCGGCGAGGCCGGGATGAG-3′; R: 5′-CTTCCTCTTGGAGAAGATC-3′. Мышь p21 : F: 5′-AACTTCGTCTGGGAGCGC-3′; R: 5′-TCAGGGTTTTCTCTTGCAGA-3′. Человек ABHD4 : F: 5′-TCACCCACTCTGTCCTTTCC-3′; R: 5′-GTGCAATCCCTTCACATCCT-3′. Человеческий PML : F: 5′-CGCCCTGGATAACGTCTTTTT-3′; R: 5′-TCCACAATCTGCCGGTACAC-3′.Человек SIDT2 : F: 5′-GCCAAATTGCTGCTTTCTTC-3′; R: 5′-TCCCTTCCATCCTTCCTCTT-3′. Человеческий H- RAS : F: 5′-GACGTGCCTGTTGGACATC-3′; R: 5′-CTTCACCCGTTTGATCTGCTC-3′. Полуколичественную ПЦР проводили с Taq PCR StarMix (GeneStar, A112-100) в термоциклере (Bio-Rad, T100) по стандартному протоколу следующим образом: 1 цикл при 95 °C в течение 3 мин; 30 циклов при 94 °С в течение 45 сек, отжиг в течение 45 сек и 72°С в течение 1 мин; окончательное удлинение при 72 °C в течение 10 мин; и выдержке при 4 °C. 10 мкл продуктов ПЦР анализировали электрофорезом через 2% агарозные гели с окрашиванием Gel-Red (Beyotime, D0139) и визуализировали с помощью системы анализа визуализации геля (LIUYI, 130-1310).Количественную ОТ-ПЦР проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad, США), а амплификацию проводили с использованием мастер-микса SYBR Green qPCR (Biotool, B21202) в соответствии с инструкциями производителя. Условия термоциклирования были установлены следующим образом: 50°С в течение 2 мин с последующей стадией начальной денатурации при 95°С в течение 10 мин, 45 циклов при 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин и кривая диссоциации при 95 °С в течение 15 с и 60 °С в течение 15 с. Все эксперименты проводились в трехкратной повторности.Кратность изменения экспрессии генов рассчитывали после нормализации до ACTB .

Вестерн-блот-анализ

Клетки лизировали с использованием модифицированного буфера RIPA, содержащего 10 мМ Tris-HCl при pH 7,5, 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1 % NP-40, 1 % дезоксихолата натрия, 0,025 % SDS и ингибиторы протеиназ. на льду 10–20 мин. Образцы белка количественно определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Macgene, MPK002), кипятили в 5 × загрузочном буфере, разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.В целом, 5% обезжиренное молоко (BD Difco, 232100) в TBS с добавлением 0,1% Tween (TBST) использовали для блокирования мембраны перед зондированием указанными антителами в TBST при 4 °C в течение ночи. Мембраны промывали TBST, а затем инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами против кролика или мыши при комнатной температуре в течение 1 ч и проявляли с помощью реагента для детекции вестерн-блоттинга ECL (ThermoFisher Scientific, 32132). Полосы блотов количественно определяли с использованием программного обеспечения ImageJ. Необрезанные сканы всех пятен в этой рукописи показаны в дополнительной информации.

Животные

Эксперименты на животных проводили на самцах мышей C57BL/6J (Jackson Laboratory, Jax 664), p53 -/- Мышей C57BL/6J (BIOCYTOGEN, BCG-DIS-0001) и BALB/c голые мыши (Vital River Laboratory Animal Technology, 401). Всех мышей содержали в особых условиях, свободных от патогенов, и использовали в соответствии с протоколами, одобренными комитетами по уходу и использованию животных Университета Цинхуа для защиты животных. Мышей первоначально рандомизировали по возрасту и весу, и на момент инъекций им было 6–8 недель.Максимальный размер опухоли, одобренный протоколом IACUC, составлял 2 см в диаметре, и он не превышался во всех экспериментах.

Создание клеточной линии EL4-Luc-GFP EL4

Ретровирусы, несущие плазмиду MSCV-Luciferase-IRES-GFP, были упакованы с помощью системы Plate-E. Для ретровирусной инфекции клетки EL4 подвергали центрифугированию вирусным раствором при 1500 ×  г в присутствии 4 мкг на мл полибрена в течение 2 часов при 32 °C. Инфицированные клетки EL4 размножали и GFP-положительные клетки отбирали с помощью FACSArial II (BD Biosciences, США) для получения клеток EL4-Luc-GFP.Чистоту клеток EL4-Luc-GFP подтверждали второй сортировкой через 1 неделю после культурального размножения. Стратегии гейтирования FACS для идентификации клеток EL4-Luc-GFP (GFP + ) были описаны, как показано на дополнительном рисунке 11a.

Модели ксенотрансплантата опухоли

Для модели ксенотрансплантата, созданной внутривенно, жизнеспособные клетки EL4-Luc-GFP дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и ресуспендировали в PBS с плотностью 5 × 10 6 клеток/мл, которые впоследствии вводили в латеральную хвостовую вену в объеме 0.1 мл. Затем мышей обрабатывали внутрибрюшинно. с носителем или аСНазой (2  ЕД на 1 г массы тела) каждые 3 дня в течение 3 недель. В эти дни мышей, у которых наблюдался паралич задних конечностей, переводили в новую клетку и кормили желеобразным кормом до конца эксперимента. Всего через 3 недели после ксенотрансплантации из хвостовой вены было взято около 100 мкл образцов крови. Всего 20 мкл образцов крови добавляли в PBS с 10% FBS и антикоагулянтом, после процедуры лизиса эритроцитов остаточные лейкоциты ресуспендировали в PBS с 10% FBS и подвергали FACS-анализу на цитометре LSR II. (BD Biosciences, США) для выявления GFP-позитивных клеток.Остальной равный объем образцов крови центрифугировали при 5600 ×  g в течение 5 мин при 4 °C для получения сыворотки и хранили при –80 °C для дальнейшего анализа. После забора крови мышей анестезировали и вводили внутрибрюшинно. с мононатриевой солью d-люциферина (6  мг на мышь) и визуализировали активность люциферазы с помощью многоспектральной системы визуализации IVIS Lumina II (Caliper, США). Мышей дополнительно кормили, чтобы задокументировать статус выживания.

Для модели ксенотрансплантата, созданной подкожно, жизнеспособные клетки EL4-Luc-GFP ресуспендировали в PBS с плотностью 1 × 10 7 клеток на мл, которые впоследствии вводили в бок задних конечностей в объеме 0.1 мл с обеих сторон. Всего через 1 неделю объем опухоли измеряли штангенциркулем, затем мышей анестезировали и вводили внутрибрюшинно. с мононатриевой солью d-люциферина (6 мг на мышь) и изображение активности люциферазы с помощью многоспектральной системы визуализации IVIS Lumina II. Затем мыши получали лечение внутрибрюшинно. с носителем или аСНазой (2  ЕД на 1 г массы тела) каждые 3 дня в течение 3 недель. Измерение объема опухоли и визуализацию биолюминесценции всей мыши проводили каждую неделю до конца эксперимента.Всего через 3 недели после ксенотрансплантации были собраны образцы крови и получена сыворотка, как указано выше. После забора крови мышей умерщвляли, а опухоли вырезали и взвешивали. Для другого теста с использованием s.c. ксенотрансплантата для изучения влияния аминокислоты на рост опухоли жизнеспособные клетки EL4-Luc-GFP ресуспендировали в PBS с плотностью 5×10 6 клеток на мл, которые затем инъецировали в бок задних конечностей в объем 0,1 мл с обеих сторон. Через день мышей кормили питьевой водой, содержащей или не содержащей 10 мМ Asn или Asp, или вводили внутрибрюшинно с 5 или 10 мМ Asn или Asp или без них в конце эксперимента.Через 10, 14 и 17 дней после ксенотрансплантации объем опухоли измеряли штангенциркулем, а затем мышей анестезировали и визуализировали in vivo, как упоминалось ранее. После визуализации получали сыворотку крови и измеряли уровни Asn и Asp с помощью ЖХ-МС, как упоминалось ранее.

Для модели ксенотрансплантата, установленной на мышах BALB/c nude, аналогичным образом жизнеспособные клетки HCT116, трансфицированные контрольной миРНК или миРНК ASNS, ресуспендировали в PBS с плотностью 1 × 10 7 клеток на мл с последующей инъекцией s.в. в бок задних ног в объеме 0,1 мл с одной стороны. Всего через 3 недели после имплантации мышей умерщвляли, опухоли резецировали, взвешивали и фотографировали.

Метаболический поток и анализ ЖХ-МС

Клетки HCT116 высевали в чашки диаметром 6 см и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки дважды промывали PBS и культивировали в среде, содержащей 4 мМ 15 N-аспартата, в течение 48 часов. Затем из клеток экстрагировали полярные метаболиты, используя соответствующий объем 100% ацетонитрила.Затем полностью вортексированные клеточные лизаты дважды центрифугировали при 14 000× g в течение 10 мин для очистки метаболитов, а растворимые фракции анализировали в режиме многореакционного мониторинга (MRM) UPLC-QQQ-MS/MS (Agilent 1290/ Тандемный масс-спектр 6460, Agilent USA). Для разделения ЖХ использовали ACQUITY UPLC® BEH HILIC, 2,1 мм × 100 мм, 1,7 мкм (Waters) с градиентным элюированием 0,1% ацетонитрила муравьиной кислоты в качестве растворителя A и 0,1% воды муравьиной кислоты в качестве растворителя B. Программа градиента следующим образом: 0–1 мин 80% А, 1–5 мин 80–50% А, 5–7 мин 50% А, 7–7.1 мин от 50% А до 80% А, 7,1–10 мин 80% А. Скорость потока была установлена ​​на уровне 0,4 мл в минуту, а объем инъекции составлял 10 мкл. Общее время работы составляло 10 мин для каждого образца.

Использование электрораспылителя Jet Stream Источник ионов ESI в режиме положительных ионов использовался для обнаружения 5 видов аминокислот, генератор азота (PEAK Shanghai) использовался для удаления растворителя и распыления, а азот высокой чистоты использовался в качестве сталкивающегося газа. Температура защитного газа составляет 350 °C, расход защитного газа составляет 10 л в минуту, температура газа составляет 325 °C, а расход газа составляет 8 л в минуту.Капиллярное напряжение 4000 В, небулизующий газ составляет 45 фунтов на квадратный дюйм, напряжение сопла 500 В.

9999 +
Соединение Предварительная ион (м / z) Продукт ION (м / z) CE CE CE
Asn 133 74 60 10
Асп 134 74 60 10
иммунопреципитация

хроматина

программное обеспечение

Genomatix промоутер инспектор (HTTP //www.genomatix.de) использовали для поиска потенциальных ответных элементов TP53 в гене ASNS с консенсусной последовательностью 5′-RRRCWWGYYY-(0-13-парный спейсер)-RRRCWWGYYY-3′, где R представляет собой пурин, Y представляет собой пиримидин, а W либо A, либо T. Последовательности для предполагаемых ответных элементов TP53 в генах ASNS : ASNS-RE1, 5′-ATCATCTTGTGGAGGCAAGTTGACA-3′; ASNS-RE2, 5′-ATGCACTGAAACTGCCATGTCCAGT-3′; ASNS-RE3, 5′-AAGTTCATGTTTAGACTTGGGTCTC-3′.

Для анализа ChIP клетки промывали PBS и сшивали 1% формальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре.Реакцию сшивания останавливали добавлением глицина до конечной концентрации 125 мМ. Лизаты клеток обрабатывали ультразвуком для получения фрагментов ДНК со средним размером менее 1000 пар оснований с последующей иммунопреципитацией указанными антителами. Связанные фрагменты ДНК элюировали и амплифицировали с помощью ПЦР. Используемые пары праймеров: ASNS-RE1, 5′-CCGCTCGAGATTTCTCAATTTATTTCGG-3′ и 5′-CCCAAGCTTCAAAAATACATCAGTGGTC-3′; ASNS-RE2, 5′-CCGCTCGAGACCTGTCTGTAGTTGGTTA-3′ и 5′-CCCAAGCTTACTGTTCTTCCTACTCCAAC-3′; ASNS-RE3, 5′-CCCTTTGCTTTCTGATGGTTCCATGTATGC-3′ и 5′-GATTGAGTATCCCTTATCTGAAATGTTTGGAACCAG-3′; p21-RE, 5′-CCGCTCGAGGTGGCTCTGATTGGCTTTCTG-3′ и 5′-CCCAAGCTTCTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3′; ACTB-RE, 5′-CTAGGCGGACTATGAC-3′ и 5′-GACTTGGGAGAGGACT-3′.

Репортерный анализ люциферазы

Вкратце, фрагмент ДНК, содержащий потенциальную р53-связывающую область, амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, используемыми в анализе ChIP, и клонировали в вектор pGL3-промотор (Promega). В целом, клетки 293T высевали за 18 часов до трансфекции в 24-луночные планшеты и временно трансфицировали 500 нг репортерной плазмиды и 500 нг экспрессирующей p53 плазмиды или носителя с использованием реагента Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific, 12566014). Активность люциферазы определяли в соответствии с инструкциями производителя (Promega).Эффективность трансфекции нормализовали на основании активности люциферазы Renilla.

Мягкий агар и анализ образования колоний

Клетки HCT116 трансфицировали контрольной миРНК или ASNS миРНК в течение 24 часов, а затем суспендировали в 1 мл среды DMEM с добавлением или без добавления 0,1 мМ аспарагина плюс 20% FBS, содержащей 0,3% агарозы. и высевают на твердую 0,6% агарозную основу в 12-луночные планшеты (5,00 клеток на лунку). Для клеток L1210 и EL4 клетки суспендировали в 1 мл среды DMEM с добавлением или без добавления 50 или 150 мкМ аспарагина плюс 10% FBS, содержащей 0.3% агарозы и высевали на твердую 0,6% агарозную основу в 12-луночные планшеты (800 клеток на лунку). Затем клетки культивировали в инкубаторе с 5% CO 2 при 37 °C в течение 2 недель. Колонии фиксировали 25% формальдегидом и окрашивали 0,0125% раствором кристаллического фиолетового до окрашивания колоний в синий цвет. Колонии затем количественно определяли путем подсчета и получали изображения.

Для анализа образования колоний 3000 жизнеспособных клеток высевали в 6-луночный планшет в трех повторностях с 2 мл культуральной среды в каждой лунке. Каждые 2 дня среду заменяли свежей до конца эксперимента.Эксперимент прекращали, когда колонии были отчетливо видны даже без наблюдения под микроскопом. Наконец, клеточные колонии фиксировали 4% раствором параформальдегида и окрашивали 0,05% кристаллическим фиолетовым до окрашивания колоний в синий цвет. Программное обеспечение ImageJ использовали для анализа площади, покрытой колониями в каждой лунке.

Анализ нарушений клеточного цикла

Клетки дважды промывали PBS и фиксировали в 75% этаноле в течение ночи при 4 °C. Затем клетки инкубировали в растворе, содержащем 0.1% Тритон Х-100, 100 мкг/мл РНКазы А и 50 мкг/мл йодида пропидия на 30 мин при 37°С в темноте. Распределение клеточного цикла анализировали с помощью цитометра LSR II (BD Biosciences, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Стратегии гейтирования FACS для анализа окрашенных PI клеток в анализе распределения клеточного цикла были описаны, как показано на дополнительном рисунке 11b.

Активность SA-β-gal, связанная со старением

Активность SA-β-gal в культивируемых клетках определяли с использованием набора для обнаружения старения (BioVision, K320-250) в соответствии с инструкциями производителя.После окрашивания клетки визуализировали и регистрировали под инвертированным микроскопом (Olympus, IX70) в светлом поле. Процент клеток, которые окрашивались положительно, рассчитывали путем подсчета 1000 клеток в случайных полях на клеточную линию.

Обнаружение апоптоза

Окрашивание TUNEL выполняли с использованием системы DeadEnd Fluorometric TUNEL в соответствии с инструкциями производителя (Promega, G3250). После окрашивания клетки наблюдали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом LSM710 (Zeiss, Германия) и регистрировали ядро, демонстрирующее ярко-зеленую флуоресценцию, как TUNEL-положительную клетку.

Для двойного окрашивания аннексина V/PI клетки собирали, дважды промывали и ресуспендировали в PBS. Апоптотические клетки идентифицировали путем двойного окрашивания моноклональным антителом аннексин-V, конъюгированным с FITC, и красителем PI в течение 30 мин с использованием набора для обнаружения апоптоза аннексина V-FITC (BD Biosciences, 556547). После окрашивания и промывки клетки анализировали на цитометре LSR II. Апоптотические клетки определяли как аннексин-V + PI клеток. Стратегии гейтирования FACS были описаны, как показано на дополнительном рис.11в.

Пролиферация и жизнеспособность клеток

Для клеточных линий лейкемии 1 × 10 5 клеток высевали в 12-луночный планшет с 1,5 мл культуральной среды, как указано, и добавляли с обработкой соединением или без нее. Всего через 2 дня клетки промывали PBS, окрашивали 0,4% раствором трипанового синего в течение 2 мин и подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток TC20 (Bio-Rad, США). Регистрировали жизнеспособные клетки и мертвые клетки. В анализе совместного культивирования 1 × 10 6 клеток HCT116 высевали в 6-луночный планшет с 2 мл культуральной среды, через 12 часов культуральную среду заменяли свежей средой, содержащей 1 × 10 5 клеток лейкемии, и далее совместное культивирование в течение 2-3 дней.Жизнеспособные клетки и мертвые клетки определяли, как указано выше. Для прилипших клеточных линий 2 × 10 6 клеток высевали в 6-луночный планшет с 2 мл культуральной среды с обработкой или без нее, как указано. Культуральную среду заменяли свежей средой каждые 2 дня, если это необходимо. В конце эксперимента определяли жизнеспособные клетки и мертвые клетки.

Измерение активности фермента ASNS in vitro

Клетки собирали в пробирки объемом 1,5 мл и 1/15 из них готовили для количественного определения белка с помощью анализа BCA, а остальные три раза промывали PBS и помещали на лед.Каждый образец ресуспендировали в 400 мкл буфера для образцов (50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ и 1 мМ PMSF), замораживали в жидком азоте и растворяли при комнатной температуре 4 раза. Экстракты клеток центрифугировали при 12 000 ×  g в течение 30 минут при 4 °C, а супернатанты применяли для анализа ферментативной активности ASNS путем взаимодействия со смесью субстратов (85 мМ Tris HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 8,33). мМ MgC1 2 , 5 мМ АТФ, 10 мМ аспарагиновой кислоты и 5 мМ глутамина).В каждой реакции 40 мкл раствора фермента добавляли к 20 мкл смеси субстратов и инкубировали с небольшими колебаниями при 37°С в течение 60 мин. Каждую реакцию проводили в трехкратной повторности. Реакционную систему помещали на лед и каждую смесь смешивали с трехкратным объемом ацетонитрила с последующим центрифугированием дважды при 14 000 ×  г в течение 10 минут для извлечения метаболитов. Asn и Glu идентифицировали и определяли количественно с помощью системы тройной квадрупольной ЖХ/МС (Agilent, 1290/6460) в соответствии с калибровочной кривой.Активность ASNS была получена путем расчета продукции Asn клеточными экстрактами с определенным количеством белка в определенный период. А единицей активности ASNS является мкг Asn в минуту на мкг общего белка (мкг мин -1 мкг на белок).

ЖХ-МС анализ метаболитов

Для образцов жидкости метаболиты в мышиной сыворотке или 200 мкл супернатантов, собранных из культуральной среды, экстрагировали 100% ацетонитрилом в соотношении 1:3. Для образцов клеток собирали адгезивные клетки и дважды промывали PBS, перед экстракцией метаболитов регистрировали количество жизнеспособных клеток.Для анализа ЖХ/МС требовалось минимум 1 × 10 5 клеток. Метаболиты в клетках экстрагировали соответствующим объемом 100% ацетонитрила. Для образцов тканей применяли ультразвуковую обработку для получения экстрактов тканей, которые центрифугировали при 14 000 ×  g в течение 20 минут при 4 °C. Супернатанты собирали и количественно определяли уровень белка с помощью анализа BCA. Метаболиты в этих супернатантах экстрагировали 100% ацетонитрилом в соотношении 1:3. Затем смеси дважды центрифугировали при 14 000 ×  g в течение 10 мин для извлечения метаболитов, а растворимые фракции анализировали в исходной концентрации или разбавляли в 80% ацетонитриле с помощью системы Triple Quadrupole LC/MS (Agilent, 1290/6460). .

Экспрессия и очистка белков

Плазмиды pRK5, меченные эпитопом Flag или HA, кодирующими полноразмерные человеческие AMPKα, LBK1 и MBP, трансфицировали в клетки HEK-293T соответственно. В целом, через 36 часов после трансфекции клетки собирали и лизировали ультразвуком в лизирующем буфере (50 мМ трис-HCl, pH 7,4, с 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 % Triton X-100), а затем центрифугировали при 13 000 ×  г в течение 10 мин при 4 °C. Шарики FLAG M2 или HA использовали для иммунопреципитации меченых белков в супернатантах в соответствии со стандартными процедурами производителя.Гранулы промывали 3-5 раз промывочным буфером (20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% TritonX-100) при 4°С на ротаторе с последующим конкурентным элюированием соответствующим синтетическим пептидом FLAG или HA в TBS или TBS. Раствор PBS в зависимости от экспериментальной цели. Очищенные белки использовали сразу или хранили при -80 °С.

Измерение активности киназы LKB1

LKB1 с активной меткой Flag был иммунопреципитирован из клеточных экстрактов клеток 293T с использованием гранул FLAG M2. Гранулы трижды промывали лизирующим буфером и дважды киназным буфером (50 мМ Трис, рН 7.5, 10 мМ MgCl 2 , 1 мМ DTT, 100 мкМ АТФ), а затем ресуспендировали в киназном буфере, содержащем увеличивающиеся концентрации Asn или Asp, в течение почти 1 часа при 4 °C на ротаторе. HA-MBP или HA-AMPKα, связанные с гранулами HA, равномерно распределяли в каждой реакции в 0,2-мл 8-полосных пробирках. Эти гранулы HA ресуспендировали в киназном буфере, содержащем LKB1, меченный Flag, и проводили киназную реакцию в течение 30 мин при 30°C на ротаторе. Образцы подвергали 8% SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом.

Анализ in vitro pull-down

Для взаимодействия AMPKα и LKB1 in vitro меченные Flag белки LKB1 и HA-меченые AMPKα экспрессировались в 293 T-клетках.Клетки лизировали, а белки подвергали иммунопреципитации с использованием шариков FLAG M2 или HA в соответствии со стандартными процедурами производителя. Белки LKB1, меченные Flag, очищали и растворяли в буфере для связывания (20 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl) с различными концентрациями Asn или Asp или без них в течение почти 1 часа при 4 °C на ротаторе. Гранулы ГК, связанные с меченой ГК AMPKα, поровну распределяли в 0,2-мл 8-полосные пробирки и промывали промывочным буфером. Затем эти гранулы HA ресуспендировали в буфере для связывания, содержащем меченные Flag белки LKB1, и инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре, пять раз промывали промывочным буфером на ротаторе и подвергали 8% SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом.

Поверхностно-плазмонный резонансный анализ

ППР анализ проводили при 25 °C на приборе Biacore T200 (GE, США) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенный LKB1 был иммобилизован на поверхности сенсорного чипа серии S CM7 (GE, 28-9538-28) в 10 мМ буфере ацетата натрия (рН 4,5), что дало почти 8000 единиц отклика. Эталонную поверхность использовали в качестве холостой пробы для корректировки инструментальных и буферных эффектов без введения белка. Количество белка, связанного с сенсорным чипом, контролировали по изменению показателя преломления.Asn или Asp растворяли в PBS и разбавляли градиентом концентраций и пропускали через каждую поверхность сенсора в восьми различных концентрациях в рабочем буфере PBS при скорости потока 30 мкл в минуту в течение 90 с (фаза контакта), после чего следовали 120 с буферный поток (фаза диссоциации). Константы диссоциации из восьми серийных разведений каждого соединения и другие кинетические параметры рассчитывали с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation версии 1.0.

CRISP/Cas9-опосредованный нокаут LKB1

Для создания линии клеток HCT116 с нокаутом LKB1 была сконструирована лентивирусная плазмида CRISPR/Cas9, нацеленная на LKB1 , путем клонирования отожженной sgRNAv в вектор pLenti-CRIS, описанный ранее 19 .sgRNA были разработаны с помощью инструмента CRISPER Design (crispr.mit.cn), и последовательности: 5′-CACCGAGCTTGGCCCGCTTGCGGCG-3′ и 5′-AAACCGCCGCCAAGCGGGCCAAGCTC-3′. В целом, клетки 293T котрансфицировали pLenti-CRISPRv2, pVSVg и psPAX2 для получения лентивирусов, которые использовали для заражения клеток HCT116 в течение 24 ч, а затем LKB1 -нокаутную клеточную линию получали путем культивирования в среде, содержащей 2  мкг/мл пуромицин в течение недели.

Анализ связывания аминокислот с радиоактивной меткой

Около пяти миллионов клеток 293T высевали в 10-см планшет, а на следующий день клетки трансфицировали 10  мкг плазмид экспрессии кДНК на основе pRK5-FLAG по отдельности, как указано в эксперименте, с помощью липофектамина. 2000.Через 48 часов после трансфекции клетки однократно промывали ледяным PBS и сразу же лизировали в течение 20 мин буфером для лизиса Triton (1% Triton, 10 мМ β-глицеролфосфат, 10 мМ пирофосфат, 40 мМ Hepes pH 7,4, 2,5). мМ MgCl 2 и ингибиторы протеиназ). Лизаты клеток очищали центрифугированием при 16 200 ×  g при 4 °C в микроцентрифуге в течение 10 мин. Для анти-FLAG-иммунопреципитации аффинные гранулы FLAG-M2 блокировали путем вращения в 1 мкг на мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 4 °C, а затем трижды промывали буфером для лизиса.Затем к осветленным клеточным лизатам добавляли 30 мкл взвеси 50/50 аффинных гранул и инкубировали с вращением в течение ночи при 4°C. После иммунопреципитации шарики промывали один раз лизирующим буфером и три раза лизирующим буфером, содержащим 500 мМ NaCl. Если в эксперименте было представлено несколько образцов одного и того же типа, гранулы были равномерно распределены по соответствующим пробиркам, чтобы обеспечить одинаковое количество белка в образцах одного типа. Для анализа связывания гранулы инкубировали в течение 1 часа на льду в цитозольном буфере (0,1% Triton, 40 мМ HEPES pH 7,4, 10 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl 2 ) с 3 мкКи [ 3 H]-меченых аминокислот с 10 мМ соответствующих холодных аминокислот или без них. Во время инкубации пробирки встряхивали каждые пять минут. По истечении одного часа шарики быстро центрифугировали, аспирировали насухо и трижды быстро промывали связывающим промывочным буфером (0,1% Triton, 40 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl). Гранулы снова отсасывали насухо и ресуспендировали в 50 мкл промывочного буфера для связывания.С помощью обрезанного наконечника каждый образец хорошо перемешивали и отдельно добавляли три аликвоты по 10 мкл в каждую лунку Isoplate-96 и проводили количественный анализ с использованием сцинтилляционного счетчика MicroBETA2 (PerkinElmer). Этот процесс повторялся попарно для каждого образца, чтобы обеспечить одинаковое время инкубации и промывки для всех образцов, проанализированных в разных экспериментах. После считывания гранулы денатурировали добавлением 50 мкл буфера для образцов и кипячением в течение 5 минут, разделяли с помощью 10% SDS-PAGE и анализировали с помощью окрашивания кумасси синим для обнаружения иммунопреципитированных белков.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение среднего (s.d.), если не указано иное. Для расчета значений P использовали непарный двусторонний критерий Стьюдента t , если не указано иное. P  < 0,05 считалось значимым. * p  < 0,05, ** p  < 0,01, *** p  < 0,001, NS незначителен.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Кратком отчете об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Новости ASN Полет Cessna Caravan при сильном обледенении способствовал вынужденной посадке в Канаде в 2014 году

C-FKAY после остановки (TSB)

Совет по безопасности на транспорте Канады (TSB) обнаружил, что неиспользование всей доступной информации о погоде и недостаточная осведомленность об ограничениях самолета в условиях обледенения привели к сильному обледенению и вынужденной посадке каравана Air Tindi Cessna 208B к западу от Йеллоунайфа. Пилот и 5 пассажиров не пострадали, но самолет получил существенные повреждения.

20 ноября 2014 года, в утренней темноте, фургон Air Tindi Cessna Caravan выполнял рейс из Йеллоунайфа в Форт-Симпсон, Северо-Западный Запад. Во время набора высоты 8000 футов самолет столкнулся с серьезными условиями обледенения, что потребовало возвращения в Йеллоунайф. На обратном пути пилот не смог удержать высоту, и в конце концов самолет коснулся замерзшей поверхности Большого Невольничьего озера. Самолет получил серьезные повреждения после удара о скалу. Пилот и пассажиры были спасены примерно через 4 часа после вынужденной посадки.

Расследование установило, что пилот недооценил серьезность и продолжительность условий обледенения, которые возникнут во время полета. Кроме того, в результате неполных расчетов веса и балансировки выяснилось, что вес самолета на 342 фунта превышает его сертифицированный максимальный вес для полета в известных условиях обледенения, а центр тяжести самолета также не находился в пределах допустимых значений. Эти факторы привели к состоянию, которое увеличило скорость сваливания самолета и уменьшило его способность к набору высоты.

Следствие также установило, что хотя пассажиры были проинструктированы о том, как открыть дверь кабины, это не позволило им сделать это после вынужденной посадки, и они должны были выйти через одну из дверей кабины. Кроме того, из-за столкновения с местностью доступ к спасательным средствам и зимней одежде, загруженным в подбрюшную гондолу, был ограничен. Таким образом, расследование пришло к выводу, что неэффективные инструктажи пассажиров и размещение аварийно-спасательного оборудования в недоступном месте были дополнительными факторами риска.

После инцидента Air Tindi временно приостановила работу Cessna Caravan, провела расследование системы управления безопасностью и предприняла ряд мер по обеспечению безопасности. К ним относятся усиленный контроль за процедурами отправки самолетов, более тщательный мониторинг погоды, улучшенная подготовка к действиям в условиях обледенения и обновление плана реагирования компании на чрезвычайные ситуации.

Дополнительная информация:

Рубрика: Отчеты о расследованиях Харро Рантера

%PDF-1.6 % 1095 0 объект > эндообъект 1121 0 объект >поток 2009-05-20T16:41:27Z2009-05-20T17:46:19-05:002009-05-20T17:46:19-05:00application/pdfuuid:8b8d5521-5ef9-4532-b212-11a2ef84ba4fuuid:ec8a65c-1-c267 411c-ac0b-33e9cb5ad0a8 конечный поток эндообъект 1115 0 объект >/Кодировка>>>>> эндообъект 1096 0 объект > эндообъект 1 0 объект >/Шрифт>/ProcSet[/PDF/Text/ImageB]>>/Тип/Страница>> эндообъект 7 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 31 0 объект > эндообъект 37 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 55 0 объект > эндообъект 61 0 объект > эндообъект 67 0 объект > эндообъект 73 0 объект > эндообъект 79 0 объект > эндообъект 85 0 объект > эндообъект 91 0 объект > эндообъект 97 0 объект > эндообъект 103 0 объект > эндообъект 109 0 объект > эндообъект 115 0 объект > эндообъект 121 0 объект > эндообъект 127 0 объект > эндообъект 133 0 объект > эндообъект 139 0 объект > эндообъект 145 0 объект > эндообъект 151 0 объект > эндообъект 157 0 объект > эндообъект 163 0 объект > эндообъект 169 0 объект > эндообъект 175 0 объект > эндообъект 181 0 объект > эндообъект 187 0 объект > эндообъект 193 0 объект > эндообъект 199 0 объект > эндообъект 205 0 объект > эндообъект 211 0 объект > эндообъект 217 0 объект > эндообъект 223 0 объект > эндообъект 229 0 объект > эндообъект 235 0 объект > эндообъект 241 0 объект > эндообъект 247 0 объект > эндообъект 253 0 объект > эндообъект 259 0 объект > эндообъект 265 0 объект > эндообъект 271 0 объект > эндообъект 277 0 объект > эндообъект 283 0 объект > эндообъект 289 0 объект > эндообъект 295 0 объект > эндообъект 301 0 объект > эндообъект 307 0 объект > эндообъект 313 0 объект > эндообъект 319 0 объект > эндообъект 325 0 объект > эндообъект 331 0 объект > эндообъект 337 0 объект > эндообъект 343 0 объект > эндообъект 349 0 объект > эндообъект 355 0 объект > эндообъект 361 0 объект > эндообъект 367 0 объект > эндообъект 373 0 объект > эндообъект 379 0 объект > эндообъект 385 0 объект > эндообъект 391 0 объект > эндообъект 397 0 объект > эндообъект 403 0 объект > эндообъект 409 0 объект > эндообъект 415 0 объект > эндообъект 421 0 объект > эндообъект 427 0 объект > эндообъект 433 0 объект > эндообъект 439 0 объект > эндообъект 445 0 объект > эндообъект 451 0 объект > эндообъект 457 0 объект > эндообъект 463 0 объект > эндообъект 469 0 объект > эндообъект 475 0 объект > эндообъект 481 0 объект > эндообъект 487 0 объект > эндообъект 493 0 объект > эндообъект 499 0 объект > эндообъект 505 0 объект > эндообъект 511 0 объект > эндообъект 517 0 объект > эндообъект 523 0 объект > эндообъект 529 0 объект > эндообъект 535 0 объект > эндообъект 541 0 объект > эндообъект 547 0 объект > эндообъект 553 0 объект > эндообъект 559 0 объект > эндообъект 565 0 объект > эндообъект 571 0 объект > эндообъект 577 0 объект > эндообъект 583 0 объект > эндообъект 589 0 объект > эндообъект 595 0 объект > эндообъект 601 0 объект > эндообъект 607 0 объект > эндообъект 613 0 объект > эндообъект 619 0 объект > эндообъект 625 0 объект > эндообъект 631 0 объект > эндообъект 637 0 объект > эндообъект 643 0 объект > эндообъект 649 0 объект > эндообъект 655 0 объект > эндообъект 661 0 объект > эндообъект 667 0 объект > эндообъект 673 0 объект > эндообъект 679 0 объект > эндообъект 685 0 объект > эндообъект 691 0 объект > эндообъект 697 0 объект > эндообъект 703 0 объект > эндообъект 709 0 объект > эндообъект 715 0 объект > эндообъект 721 0 объект > эндообъект 727 0 объект > эндообъект 733 0 объект > эндообъект 739 0 объект > эндообъект 745 0 объект > эндообъект 751 0 объект > эндообъект 757 0 объект > эндообъект 763 0 объект > эндообъект 769 0 объект > эндообъект 775 0 объект > эндообъект 781 0 объект > эндообъект 787 0 объект > эндообъект 793 0 объект > эндообъект 799 0 объект > эндообъект 805 0 объект > эндообъект 811 0 объект > эндообъект 817 0 объект > эндообъект 823 0 объект > эндообъект 829 0 объект > эндообъект 835 0 объект > эндообъект 841 0 объект > эндообъект 847 0 объект > эндообъект 853 0 объект > эндообъект 859 0 объект > эндообъект 865 0 объект > эндообъект 871 0 объект > эндообъект 877 0 объект > эндообъект 883 0 объект > эндообъект 889 0 объект > эндообъект 895 0 объект > эндообъект 901 0 объект > эндообъект 907 0 объект > эндообъект 913 0 объект > эндообъект 919 0 объект > эндообъект 925 0 объект > эндообъект 931 0 объект > эндообъект 937 0 объект > эндообъект 943 0 объект > эндообъект 949 0 объект > эндообъект 955 0 объект > эндообъект 961 0 объект > эндообъект 967 0 объект > эндообъект 973 0 объект > эндообъект 979 0 объект > эндообъект 985 0 объект > эндообъект 991 0 объект > эндообъект 997 0 объект > эндообъект 1003 0 объект > эндообъект 1009 0 объект > эндообъект 1015 0 объект > эндообъект 1021 0 объект > эндообъект 1027 0 объект > эндообъект 1033 0 объект > эндообъект 1039 0 объект > эндообъект 1045 0 объект > эндообъект 1051 0 объект > эндообъект 1057 0 объект > эндообъект 1063 0 объект > эндообъект 1069 0 объект > эндообъект 1075 0 объект > эндообъект 1081 0 объект > эндообъект 1087 0 объект > эндообъект 1089 0 объект >поток x+57630P

Структурная основа для узнавания субстрата, лигирования и активации гиперактивной пептидной лигазой Asn из Viola yedoensis

РЕФЕРАТ

Пептидные аспарагиниллигазы (PAL) относятся к ограниченному классу ферментов растений, продуцирующих циклотиды, которые выполняют функцию -специфические реакции лигирования после связывания пептида-мишени Asx (Asn/Asp) с активным центром лигазы.Каким образом PAL специфически распознают свои полипептидные субстраты, оставалось неясным, особенно на стороне первичного связывания фермента. Здесь мы зафиксировали VyPAL2, каталитически эффективный PAL из Viola yedoensis , в активированном состоянии со связанным субстратом и без него. Связанная структура показывает одну лигазу с N-концевым полипептидным хвостом другой молекулы лигазы, захваченной в ее активном центре, показывая, как Asx встраивается в карман S1 фермента и почему гидрофобный остаток необходим в положении субстрата P2’.Эти результаты не только иллюстрируют роль, которую играют остатки P1 и P2′ в качестве первичных якорей для ферментативной реакции, но и дают механистическое объяснение роли остатка «привратника» на поверхности кармана S2 в смещении нештриховой части субстрата и, как следствие, активность в отношении либо лигирования, либо гидролиза. Эти результаты детализируют молекулярные события, происходящие во время созревания профермента в вакуолярном компартменте растений, предполагают механизм лигирования и дают информацию для разработки пептидных лигаз с индивидуальной специфичностью.

Резюме одним предложением Мы захватили VyPAL2, каталитически эффективную растительную пептидную лигазу со связанным субстратом, обеспечивающую молекулярную основу для распознавания субстрата и лигирования.

ВВЕДЕНИЕ

Пептидлигазы, такие как Sortase A (Schneewind et al., 1992), представляют собой привлекательные инструменты для конъюгации белков (Mao et al., 2004), полусинтеза белков (Noike et al., 2015; Cao et al., 2016), циклизация пептидов (Antos et al., 2009) или мечение живых клеток (Bi et al., 2017). Лигазы, извлеченные из растений, могут сыграть решающую роль в активной области «молекулярной эпигенетики», где необходимы точные инструменты, например, для производства изысканно модифицированных гистоновых белков (Bagert and Muir, 2021). После открытия циклотидоподобных белковых последовательностей в злаковых культурах (Mulvenna et al., 2006) и осознания того, что эти циклические полипептиды зависят от аспарагинилэндопептидаз растений для созревания (Mylne et al., 2012), поиски клонирования этих ферментов был начат.В 2014 году пептидная лигаза, специфичная для Asn, была успешно выделена из растения-продуцента циклотидов Clitoria ternatea и названа бутелазой 1 (Nguyen et al., 2014). По сравнению с бактериальной Сортазой А бутеляза 1 является гиперактивной пептидной лигазой (PAL) с заявленной каталитической эффективностью 1 314 000 M -1 с -1 , которая оказалась полезной для многих применений (Cao et al., 2016; Bi et al., 2017; Nguyen et al., 2015a, 2015b; Cao et al., 2015; Nguyen et al., 2016a, 2016b). Впоследствии несколько PAL, включая OaAEP1b (Harris et al., 2015), HeAEP3 (Jackson et al., 2018) и VyPAL2 (Hemu et al., 2019), были идентифицированы из других растений, продуцирующих циклотиды: Oldenlandia affinis, Hybanthus enneaspermus и Viola yedoensis соответственно.

Аспарагинилэндопептидазы (AEP или легумаины, EC 3.4.22.34 (Kembhavi et al., 1993)) принадлежат к подсемейству C13 цистеиновых протеаз. Легумаины, такие как бутелаза 2 (Serra et al., 2016), OaAEP2 (Serra et al., 2016) и HaAEP1 из подсолнечника Helianthus annuus (Haywood et al., 2018), преимущественно обладают протеазной активностью при нейтральном рН, с низкий уровень активности пептидлигазы (Haywood et al., 2018; Далл и Брандштеттер, 2013 г.; Чжао и др., 2014 г.; Заунер и др., 2018а; Далл и др., 2020, 2021). Третья группа ферментов, включая CeAEP из фасоли (Bernath-Levin et al., 2015), PxAEP3 из Petunia x hybrida (Jackson et al., 2018), AtLEGγ из Arabidopsis thaliana (Zauner et al., 2018a) или VyAEP1. из Viola yedoensis (Hemu et al., 2019), катализируют при рН, близком к нейтральному, образование как продуктов лигирования, так и продуктов гидролиза из пептидных субстратов, несущих соответствующие последовательности распознавания аминокислот.В отличие от этих двух групп «бифункциональных» или «преобладающих» AEP, бутелаза 1 (Nguyen et al., 2014), OaAEP1b (Harris et al., 2015), OaAEP3-5 (Harris et al., 2019) и VyPAL2 (Hemu et al., 2019) в основном катализируют образование продуктов лигирования, в то время как гидролитический продукт практически не наблюдается ни при нейтральном, ни при кислом pH.

В растениях все эти ферменты (имеющие активность либо преимущественно Asx-пептидной лигазы, эндопротеазы или гибридной протеазы/лигазы) экспрессируются в виде неактивных зимогенов.Экспрессированный белок содержит сигнальный пептид вакуолярной адресации, N-концевой продомен, каталитический коровый домен и С-концевой кэп-домен, который покрывает активный сайт свернутого профермента (Kuroyanagi et al., 2002). Автоактивация осуществляется in vivo в кислом вакуолярном компартменте растения, что приводит к превращению профермента в его зрелую активную форму посредством протеолиза незрелой полипептидной цепи предположительно в транс (Nguyen et al., 2014). Точно так же активацию рекомбинантного профермента in vitro обычно проводят в лаборатории при значениях pH в диапазоне от 4 до 5: в этих кислых условиях зимоген подвергается автолитической активации, что приводит к удалению как про-, так и кэп-доменов в N- и С-концы каталитического ядра (Harris et al., 2015; Джексон и др., 2018 г.; Хему и др., 2019; Yang et al., 2017) и к высвобождению зрелых активных ферментов с активным центром, полностью экспонированным растворителю. Таким образом, аутоактивация — это разовая способность этих ферментов катализировать реакцию гидролиза, независимо от доминирующей активности активированной зрелой формы (протеазы или лигазы), что поднимает вопрос о точном каталитическом механизме, лежащем в основе аутоактивации фермента.

И AEP, и PAL имеют высокий уровень структурного сходства, что позволяет предположить, что их ферментативная активность контролируется тонкими структурными различиями в ключевых позициях вблизи каталитического центра (Hemu et al., 2019). Недавние структурно-функциональные исследования выявили важные детерминанты образования пептидов, которые были названы «маркером лигазной активности» (Jackson et al., 2018) и «детерминантами лигазной активности» (Hemu et al., 2019). Было предложено, чтобы локальные структурные особенности, непосредственно окружающие сайт связывания S1 Asx, контролировали (i) конформацию связанных пептидных субстратов (ii) кинетику отщепления пептида от непервичного сайта фермента (iii) доступ к S- промежуточное соединение ацилфермента либо молекул воды, что приводит к гидролизу пептидного субстрата, либо, альтернативно, входящего нуклеофила, что приводит к лигированию, на основной стороне.Были предложены некоторые эмпирические правила (Hemu et al., 2019), которые в значительной степени подтвердились благодаря успешному превращению бутелазы 2, чистой протеазы Asx, в «подобную бутелязе 1» пептидную лигазу Asx путем исключительно мутации остатков ее S2 ( Детерминанта активности лигазы 1 или LAD1) и S1′ (LAD2) субстрат-связывающие карманы, в то время как мутации в других положениях, отличных от LAD, оказывали лишь ограниченное влияние на активность (Hemu et al., 2020).

Особое функциональное значение имеет остаток «привратника», расположенный на поверхности кармана S2 (LAD1).Первоначально обнаруженный в ходе систематического исследования направленного мутагенеза OaAEP1b, слабоактивный PAL, выделенный из Oldenlandia affinis: привратник, которым является Cys247 в ферменте OaAEP1b дикого типа, играет ключевую роль в контроле как направленности, так и кинетики реакция лигазы против протеазы (Yang et al., 2017). Одной мутации Cys247 в Ala было достаточно, чтобы увеличить значение kcat/Km для лигирования более чем в 150 раз по сравнению с ферментом WT OaAEP1b. Аналогичным образом родственная замена остатка Gatekeeper Gly252 бутелазы 2 на такие остатки, как Val или Ile, дала мутанты бутелазы 2 с заметно повышенной лигазной активностью (Hemu et al., 2020). Таким образом, наличие остатка Gly в положении гейткипера в аминокислотной последовательности фермента указывает на преимущественно протеазную активность зрелого фермента, в то время как остатки с алифатическими боковыми цепями в этом положении способствуют лигазной активности (Hemu et al., 2020, 2019).

Несмотря на публикацию нескольких кристаллических структур AEP и PAL растений, либо в их проферментных, либо в активных формах, лишенных кэп-домена (Hemu et al., 2019; Haywood et al., 2018; Dall and Brandstetter, 2013; Zhao и другие., 2014; Заунер и др., 2018а; Ян и др., 2017; James et al., 2019), наше понимание механистического и структурного значения остатков LAD1 и LAD2 и Gatekeeper остается неполным. Здесь мы искали структурные детерминанты, отвечающие за распознавание субстрата и лигазную активность VyPAL2, очень эффективного PAL, обнаруженного путем изучения транскриптома Viola yedoensis, который может быть удобно экспрессирован в рекомбинантной форме (Hemu et al., 2019). Мы получили кристаллические структуры после индуцированной кислотой аутоактивации, включая одну структуру, в которой остатки N-концевого пропептида одной молекулы лигазы связаны с активным центром соседней молекулы в кристаллической решетке.Насколько нам известно, на данный момент эта структура дает полное атомарное представление о связывании субстрата, в том числе на первичной стороне фермента. Наряду с подтверждающими биохимическими и ферментативными данными раскрываются ключевые структурные особенности, связанные с распознаванием специфического субстрата, и предлагается проверяемый механизм активности пептидной лигазы, в котором гейткипер играет решающую роль, что согласуется с наблюдениями за кинетикой. Более того, изучение аутоактивации проферментов VyPAL2, несущих мутации в своих каталитических остатках His и Cys, указывает на альтернативные пути, используемые этими ферментами для процесса их созревания и проявления их каталитической активности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Лигазная активность и кристаллическая структура активированного фермента

VyPAL2 экспрессировали, очищали и активировали с использованием описанной процедуры (Hemu et al., 2019). Чтобы соответствовать LAD1 бутелазы 1, которая имеет самую высокую активность лигазы, задокументированную до сих пор (Nguyen et al., 2014; Hemu et al., 2019, 2020), одиночный мутант профермента VyPAL2 с мутацией I244V в положении привратника (VyPAL2-I244V) также экспрессировали, очищали и аналогичным образом активировали.Вкратце, активацию проводили путем инкубации профермента при pH 4,4 в течение 2 часов при 37 ° C с последующей хроматографией с исключением по размеру для очистки основного каталитического домена (рис. 1A; дополнительная рис. 1). После активации как для VyPAL2, так и для VyPAL2-I244V на SDS-PAGE наблюдается зависящее от времени уменьшение количества профермента 50 кДа. Это сопровождается появлением полосы около 37 кДа, соответствующей активной форме, и активация завершается через 2 часа инкубации (рис. 1А и 1В).

Рисунок 1.

Экспрессия, активация, лигазная активность и кристаллическая структура VyPAL2-I244V. (A) Схематическое изображение последовательности VyPAL2-I244V. Соответствующие гены VyPAL2, кодирующие полные аминокислотные последовательности, клонировали в вектор экспрессии с заменой сигнального пептида на гекса-His-метку для аффинной очистки (см. методы). Каталитические остатки и фрагмент аспартимида (Snn171) рядом с каталитическим His172 обозначены коричневым цветом, сайты N-связанного гликозилирования обозначены голубым цветом, а границы доменов, полученные с помощью ЖХ-МС/МС, обозначены черным цветом (см. также SI ссылки 18).Сайты протеолитического расщепления указаны стрелками над N- и С-концевыми последовательностями. Продукты активации профермента при низком pH анализировали с использованием (B) SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим. Инкубация VyPAL2 в течение двух часов приводит к полностью созревшему ферменту. (C) активность лигазы с использованием анализа FRET. (D) Сравнение кристаллических структур мономера профермента VyPAL2 (правая панель, код доступа PDB: 6IDV ref: 18) и активированного белка VyPAL2 (левая панель, эта работа). Белки показаны с помощью α-спиралей в виде лент и β-цепей в виде стрелок.Цветовой код, используемый для каждого из трех доменов проферментов, используется на протяжении всей рукописи (ядерный домен: зеленый, кэп-домен: пшеница, линкерная область, соединяющая каталитическую сердцевину и кэп-домен, выделена оранжевым цветом).

Затем мы определили активность пептид-лигазы фермента VyPAL2 WT и VyPAL2-I244V с помощью флуорометрического анализа, позволяющего отслеживать в реальном времени образование лигированного пептидного продукта (рис. 1C). Два модельных пептидных субстрата с аминокислотными последовательностями PIE(EDANS)YNAL и GIK(DABSYL)SIP, содержащие мотивы распознавания трипептида NAL и дипептидлигазы GI на их С- и N-концах соответственно, были флуоресцентно мечены.После лигирования сигнал флуоресценции фрагмента EDANS первого пептида гасится фрагментом DABSYL второго пептида, в то время как дипептид AL высвобождается (рис. 1C). Реакции лигирования VyPAL2 и VyPAL2-I244V проводились при 37 ° C в течение 2 минут для определения начальной скорости при pH 6,5 (рис. 1C). Значение Vmax VyPAL2-I244V (53,76 RFU/с) увеличено примерно в 2 раза по сравнению с ферментом WT VyPAL2 (28,68 RFU/с), а значения Km были сопоставимы с Km=9.351 мкМ для фермента WT и 7,455 мкМ для VyPAL2-I244V (рис. 1C).

Очищенные автоактивированные белки VyPAL2 и VyPA12-I244V затем концентрировали до 6,7 мг/мл и 4,5 мг/мл соответственно перед кристаллизацией. Хорошо дифракционные кристаллы, появляющиеся через 3-5 дней, закрепляли на криопетле и мгновенно замораживали в жидком азоте. Интенсивность дифракции рентгеновских лучей достигала разрешения 2,3 и 1,59 Å для VyPAL2 и VyPA12-I244V соответственно, и структуры их активных форм определялись путем молекулярного замещения с использованием корового домена структуры профермента VyPAL2 в качестве поискового зонда (Hemu et al. ., 2019) (дополнительная таблица 1). В асимметричном звене присутствуют две по существу идентичные молекулы. Небольшой интерфейс между этими двумя молекулами исключает образование функционального димера в растворе, связанного с наблюдаемым объемом элюции в эксклюзионной хроматографии, соответствующим мономеру с кажущейся молекулярной массой ~40 кДа. Структура активного фермента, включающая остатки от Ile51 до Glu331, принимает архитектуру консервативного корового домена, также наблюдаемую у легумаинов: центральный β-слой, содержащий шесть β-цепей, окруженных пятью большими и четырьмя меньшими α-спиралями (рис. 1D).По сравнению с эквивалентным коровым доменом в контексте незрелого профермента VyPAL2 (Hemu et al., 2019) при созревании не происходит серьезных структурных изменений, на что указывает среднеквадратичное отклонение (RMS) 0,3 Å для 276 наложенных α- углерод (рис. 1D). Таким образом, активация, по-видимому, мало влияет на структуру сердцевинного домена, кроме удаления кэпа, что приводит к полному воздействию растворителя и диффундирующих белковых субстратов на каталитический сайт (рис. 1D). Структуры VyPAL2 и VyPAL2-I224V очень напоминают r.м.с.д. 0,171 Å (дополнительная фигура 4). Дальнейшие сравнения с другими активными PAL, такими как AtLEGγ (Zauner et al., 2018b) (код доступа PDB: 5OBT), HaAEP1 (Haywood et al., 2018) (код PDB: 6AZT) или бутелазы 1 (James et al., 2019) (код PDB: 6DHI), возвращает среднее среднеквадратичное значение. значение 0,5 Å (дополнительная таблица 2), подтверждающее, что при созревании ферментов не происходит серьезных изменений конформации.

Чтобы лучше понять механизм автоактивации, мы рассчитали распределение электростатических зарядов на границе ядра VyPAL2 с доменом крышки (дополнительная фигура 2).Расчеты проводились при значении рН 6,5, при котором интерфейс профермента стабилен, и при рН 4,4, близком к рН, обнаруженному в компартменте вакуоли и также используемому для активации профермента in vitro. При рН, близком к нейтральному, остатки, выставленные из основного домена, в целом нейтральны или слегка отрицательно заряжены, в то время как контактирующие остатки, выставленные на поверхность кэп-домена, несут слегка положительный заряд (дополнительная фигура 2). Вместе с комплементарностью формы эти противоположные электростатические заряды способствуют образованию стабильного интерфейса между этими двумя доменами, что объясняет большую термостабильность профермента.Однако при подкислении как интерфейсные области кэп-, так и кор-доменов становятся сильно положительно заряженными из-за протонирования нескольких боковых цепей His, Asp и Glu, выставленных на поверхность. Это приводит к сильному электростатическому отталкиванию между доменами ядра и кэпа, а дестабилизация интерфейса, вероятно, облегчит доступ линкерной области к активному сайту фермента, способствуя трансактивации и высвобождению зрелого домена ядра (Дополнительный фильм 1).

Рисунок 2.

Экспрессия, обработка и кристаллическая структура VyPAL2-C214A.(A) Схематическое представление последовательности VyPAL2-C214A (левая панель) и инкубация VyPAL2-C214A в течение одного часа приводит к полностью процессированному ферменту («активированная форма», правая панель). (B) Схема кристаллической упаковки, показывающая, как молекулы VyPAL2-C214A уложены друг на друга в моноклинной элементарной ячейке C2. Молекулы, связанные переносом элементарной ячейки вдоль b, отображаются в виде лент одного цвета, в то время как молекулы, связанные осью 2-го порядка вдоль той же оси, отображаются зеленым и красным (средняя панель).N-концевой хвост каждой молекулы вставляется в молекулу, расположенную снизу. (C) N-концевой пептид, связанный с ферментом. Молекулярная поверхность пептидлигазы показана серым цветом. Наложена разностная карта Фурье, отображаемая в виде синей сетки с коэффициентами 2Fo-Fc с фазами, формирующими уточненную модель, очерченными на уровне 1σ выше среднего.

Кристаллизация комплекса фермент-субстрат

Для улавливания комплекса с пептидным субстратом был получен одиночный мутант VyPAL2 путем замены каталитического Cys214 на аланин.Примечательно, что этот мутантный активный сайт подвергается быстрому созреванию при кислом рН, и его коровый домен может быть очищен с использованием процедуры, сходной с ферментом дикого типа (рис. 2А). Более того, автоактивация VyPAL2-C214A происходит даже быстрее, чем VyPAL2-I244V, поскольку полная обработка профермента наблюдается всего через 60 минут по сравнению с 2 часами для VyPAL2-I244V (рис. 1B и 2A; дополнительная фигура 3). В предыдущих исследованиях была критически изучена роль оксианионной дырки в протеазе субтилизина (Bryan et al., 1986) и это будет обсуждаться ниже в свете имеющихся данных. Как и ожидалось, VyPAL2-C214A показал сильно сниженную активность в нашем анализе лигирования пептидов, подтверждая решающую роль Cys214 в реакциях лигирования и циклизации, но не для созревания.

Рисунок 3.

Канавка для связывания пептидов и распознавание субстрата с помощью VyPAL2. (A) На левой панели показана бороздка для связывания пептидов лигазы, полученная из кристаллической структуры VyPAL2 (дополнительная таблица 1, эта работа). Правая панель получена из структуры VyPAL2-C214A (дополнительная таблица 1, форма I, эта работа), связанного с пептидом, показанным пурпурным цветом.(B) Остатки, выстилающие карманы для привязки субстрата, изображены в виде палочек. Основной домен VyPAL2 представлен в виде серой поверхности. Карман S1 — красный, карман S3 — пурпурный, карман S1 — синий, карман S2 — голубой. (C) Остатки активного центра His172 и C214 (мутированные здесь в Ala) находятся на противоположных сторонах пептидного субстрата, и моделирование обратной сульфгидрильной группы в A214 показывает, что расстояние с разрезаемым углеродом согласуется с прямой атакой атома углерода. карбонильной группы, как показано.

После созревания при кислом рН и очистки активированной формы хорошо дифракционные кристаллы корового домена VyPAL2-C214A можно было получить в двух условиях (см. методы): в то время как кристаллы формы I растут через 3-5 дней, кристаллы формы II кристаллы растут только после 2 месяцев инкубации (рис. 2А). Для этих двух кристаллических форм можно было собрать данные рентгеновской дифракции с разрешением 1,9 и 1,8 Å соответственно (дополнительная таблица 1). Кристаллы формы I содержат один мономер на асимметричную единицу, а молекулы упакованы в шахматном порядке вдоль уникальной оси b (рис. 2В).Остатки белка от Ser44 до Val329 можно было с уверенностью проследить на карте электронной плотности, включая остатки Asn43-Asp49 в N-концевой области расщепляемого профермента, которые можно было уверенно построить в четко определенной электронной плотности (рис. 2C). В частности, разрывная P1-P1′ (Schechter and Berger, 1967) связь Asp49-Ser50 не расщепляется ни во время одночасовой стадии активации при низком pH, ни во время последующих стадий очистки и кристаллизации (в течение 3-5 дней). Как и ожидалось, этот отщепляемый N-концевой хвост кажется гибким и выступает в сторону от каталитического ядра фермента.В кристаллической решетке этот хвост встраивается в активный центр соседней молекулы, связанной с первой кристаллографической диадой по оси b (рис. 2Б и 2С). Таким образом, в кристаллической решетке N-концевая область (Asn43-Asp49) молекулы занимает активные центры молекулы, расположенной непосредственно под ней (рис. 2Б и 2С). Следует отметить, что Asp49 глубоко спрятан в кармане S1 (рис. 3А и 3В), в то время как остатки Asp47, Asp48, Ser50 и Ile51 занимают карманы S3, S2, S1’ и S2’ соответственно (рис. 3 и 4).Эти наблюдения согласуются с ранее опубликованными результатами ЖХ-МС/МС, демонстрирующими, что С-концевая пептидная связь с Asp49 VyPAL2 представляет собой один из возможных N-концевых участков созревания проэнзима18. Следовательно, N-концевой пептид Asn43-Ile51, связанный с активным центром VyPAL2-C214A, вероятно, представляет собой фермент-субстратный комплекс, захваченный во время N-концевого созревания. Помимо сайта расщепления Asp49, несколько других возможных протеолитических сайтов были обнаружены с помощью экспериментов ЖХ-МС/МС на Asn43, Asn46 и Asp48 (см. рисунок S3 Hemu et al., 2019).

Рисунок 4.

Подробные изображения кармана специфичности лигазы. Увеличенные изображения карманов специфичности S3-S2 VyPAL2. Для каждого кармана родственный пептидный субстрат (палочки) окрашен в пшеничный (A, P3), серый (B, P2), красный (C, P1), синий (D, P1′) и голубой (E, P2′) в то время как остальная часть пептида выделена серым цветом. Остатки из карманов специфичности окрашены в пурпурный (A, S3), красный (B, S2), красный (C, S1), синий (D, S1′) и голубой (E, S2′) и показаны в виде палочек и помечены . Полярные взаимодействия между остатками субстрата и остатками, выстилающими карманы специфичности (водородные связи или солевые мостики), показаны пунктирными линиями.Наложена разностная карта Фурье, отображаемая в виде синей сетки с коэффициентами 2Fo-Fc с фазами, формирующими уточненную модель, очерченными на уровне 1σ выше среднего.

После обработки при низком pH мы получили кристаллы VyPAL2-C214A в другом состоянии (форма II; дополнительная таблица 1). В то время как кристаллы формы I VyPAL2-C214A со связанным N-концевым пептидом, описанным выше (дополнительная таблица 1), появлялись в течение 5 дней, кристаллы формы II растут только после двухмесячной инкубации, что согласуется с гораздо более медленной кинетикой аутопротеолиза. остатков 43-49 с помощью VyPAL2-C214A по сравнению с С-концевой кэп-областью.В кристаллической форме II VyPAL2-C214A N-концевой хвост был отщеплен (дополнительная фигура 4), и теперь полипептидная цепь простирается от Ser50 до Val329. В совокупности эти результаты показывают, что структура комплекса VyPAL2-C214A (форма I) представляет собой комплекс фермент-субстрат, в то время как форма II захватывает продукт этого медленного N-концевого расщепления.

Общая архитектура фермент-субстратного комплекса

Кристаллы формы I дают уникальную возможность проанализировать связывание субстрата для активированного PAL и сравнить его с несвязанной автоактивируемой структурой.Связанный N-концевой пептид находится в неглубокой бороздке на поверхности лигазы, и межмолекулярные взаимодействия между лигазой и ее субстратом, по-видимому, в первую очередь опосредуются остатками P1 Asp49 и Ile51 (P2′), которые действуют как две точки крепления (рис. 3A и 3Б). Мономер может быть наложен на активированную структуру VyPAL2-I244V со среднеквадратичным значением 0,21 Å. Таким образом, связывание N-концевого субстрата Asn43-Ile51 не сопровождается значительными конформационными изменениями (сравните левую и правую панели на рис. 3А).Asp49 связывается в кармане S1, как и следовало ожидать от изостерического субстрата P1 фермента аспарагина. При кислом рН 4,5, используемом для получения кристаллов формы I, как карбоксильная боковая цепь Asp49, так и Glu212 и Asp263, присутствующие в кармане S1, вероятно, будут протонированы, что способствует связыванию, в то время как связывание будет неблагоприятным при нейтральном рН (Zhang et al. др., 2021). Поскольку N-концевая область Asn43-Ile51 представляет собой каталитически функциональный субстрат, расположенный в активном центре, мы использовали эту экспериментальную структуру для моделирования активного комплекса фермент-субстрат, имеющего обратную сторону Cys в положении 214, связанную с остатками от P3 до P2’.Такой комплекс позволяет точно определить карманы связывания фермента S3-S2’ (рис. 3В и 4).

Затем мы сравнили способ связывания этого N-концевого пептида с тем, который наблюдается, когда кэп связывается с тем же карманом активного центра. Протеолитически чувствительный сегмент кэпа, вставленный в активный центр профермента, удерживает его в неактивном состоянии (Yang et al., 2017). Хотя две полипептидные цепи частично перекрываются, особенно две амидные группы из Gln323 и Asp49 в кармане S1, остатки Asn43-Gly52 (эта работа) идут в противоположном направлении по сравнению с остатками Ile341-His344 кэп-домена (код доступа PDB: 6IDV). ; Дополнительный рисунок 5).

Рисунок 5.

Роль позиции Gatekeeper в позиционировании подложки. (A) Структура комплекса фермент-субстрат, смоделированная на основе экспериментальной структуры VyPAL2-C214A (дополнительная таблица 1, форма I). Ala214 был заменен цистеином. Ядро фермента показано в виде лент и окрашено в серый цвет. Каталитические Cys214 и His172, а также остаток привратника Ile244 показаны в виде палочек. Также показаны атомы водорода His172. Субстрат P4-P2’ (NDDDSI) показан в виде палочек, окрашенных в пурпурный цвет, а карта электронной плотности 2Fo-Fc с контуром 1σ и окрашена в голубой цвет.(B) Структура комплекса фермент-ингибитор AtLEGg (код PDB: 5OBT). Ядро фермента показано в виде лент и окрашено в голубой цвет. Каталитические остатки Cys219 и His172, а также остаток Gly249 Gatekeeper показаны в виде палочек. Ковалентный ингибитор P4-P1 (YVAD-CMK) показан в виде палочек, окрашенных в голубой цвет. Предлагаемая нуклеофильная молекула воды, показанная красной сферой, расположена на расстоянии 2,9 Å от His172 на оси тиоэфирной связи между Cys219 и остатком P1 Asp-CMK. Для справки положение подложки VyPAL2-C214A, наложенной на структуру, связанную с AtLEGg, представлено линиями и окрашено в пурпурный цвет.(C) Структура комплекса фермент-субстрат на основе моделирования VyPAL2-C214A-I244G MD. Ядро фермента отображается в виде зеленых лент. Каталитические Cys214 и His172, а также остаток привратника Gly244 показаны в виде палочек. Также показаны атомы водорода His172. Область субстрата P4-P2’ (NDDDSI) показана в виде палочек и окрашена в зеленый цвет. Когда привратником является глицин, пептид смещается, и расстояние между карбонильной и имидазольной боковой цепью составляет 5,0, так что водородная связь не образуется.В этой конфигурации His172 легко доступен для активации входящей молекулы воды. (D) Нанесено расстояние между атомом водорода His172 Ne и карбонильным кислородом Asp48 в ходе моделирования методом МД.

Реакцию лигирования, катализируемую VyPAL2, можно разделить на две стадии: во-первых, нуклеофильная атака каталитическим цистеином карбонила остатка P1, приводящая к образованию ацилфермента, разрушающего пептидную связь между остатками P1 и P1’. За этим следует на втором этапе нуклеофильная атака входящего пептида N-концевого амина на ацилфермент и освобождение от каталитического цистеина.Здесь разрывная амидная связь P1-P1’ находится между остатками Asp49 и Ser50, а карбонильная часть Asp49 расположена на расстоянии 2,9 Å от атома Sγ каталитического Cys214 (рис. 3C). Это расстояние совместимо с образованием промежуточного соединения ацил-фермент, что подтверждает пригодность настоящей структуры для представления комплекса фермент-субстрат.

Подробный анализ связывания и специфичности субстрата VyPAL2

Насколько нам известно, данная структура является первой, раскрывающей полный комплекс фермент-субстрат для пептидной лигазы, позволяющий полностью определить сайты связывания как в основных, так и в неосновных положениях ( Рисунок 4).Это также позволяет однозначно определить остатки, принадлежащие LAD: здесь LAD1 образован остатками Trp243-Ile244-Thr245, а LAD2 включает дипептид Ala174-Pro175. LAD2 в значительной степени картируется в кармане S2 ‘, хотя он не образует прямых взаимодействий с остатками P1′-P2’ субстрата. LAD1 воздействует на карманы S2 и S3, а Trp243 также способствует формированию кармана S1 (Рис. 4).

Общая площадь поверхности раздела между субстратом и белком составляет 435 A 2 , а общая энергия связывания составляет -11.7 ккал/моль. Как уже говорилось, остатки P1 и P2’ представляют собой основные якоря для поддержания субстрата с наибольшей площадью скрытой поверхности при комплексообразовании 112 Å 2 и 128 Å 2 в карманах S1 и S2’ соответственно (рис. 4). Карман S1 образован отрицательно заряженными остатками (при нейтральном рН) с одной стороны кармана (Ser242, Asp263 и Glu212) и положительно заряженными остатками с другой стороны (Arg69 и His70). Эта «полярность» способствует прочному связыванию аспарагина P1, обеспечивая водородные связи с атомами кислорода и азота его боковой цепи.Карбоксилатная боковая цепь Asp49 тесно перекрывается с таковой Asp ингибитора Ac-YVAD-CMK в связанной структуре AtLEGγ (код доступа в PDB: 5OBT) и с амидной боковой цепью Asn из трипептида AAN в связанной структуре HaAEP1 (PDB код доступа: 6AZT). При рН 4,5 кристаллизации комплекса VyPAL2-C214A Asp49 (остаток P1), вероятно, лишь частично заряжен отрицательно, в то время как боковые цепи His70 и Arg69 предположительно заряжены положительно. Отрицательный заряд, переносимый карбоксилатной боковой цепью Asp49, связанной в кармане S1, нейтрализуется за счет образования двух водородных связей с гуанидиновой группой Arg69 и с имидазольной группой His70 (рис. 4).Интересно, что в кармане S1 остается место, которое может вмещать небольшие аддукты на боковой цепи Asx, что согласуется с наблюдением, что N-гидрокси-Asn также может использоваться в качестве субстрата для VyPAL2 (Xia et al., 2021).

На праймированной боковой области субстрата в S2’-кармане Tyr185 и алифатическая цепь Lys177 устанавливают ван-дер-ваальсовые взаимодействия с остатком P2’. Пол этого кармана образован атомами скелета остатков Ile178 и Gly179 на расстоянии 3,6 Å от боковой цепи Ile51.Форма и химическая природа этого большого кармана объясняет селективность в отношении гидрофобных остатков на P2’, наблюдаемую в нескольких PAL (Hemu et al., 2019; Nguyen et al., 2014). После P2′ полипептидная цепь субстрата делает крутой поворот, так что остатки P3′ и далее не контактируют (рис. 2 и 4). В отличие от P2′, боковая цепь Ser50 (остаток P1′), которая имеет меньшую площадь скрытой поверхности 72 Å 2 (рис. 4), направленную в сторону от молекулярной поверхности лигазы, что согласуется с более слабой специфичностью, наблюдаемой в положении P1′ (Hemu et al., 2019; Нгуен и др., 2014). остаток P1′, по-видимому, играет косвенную роль в связывании: в то время как остаток Pro индуцирует жесткую петлю в структуре пептида и, следовательно, неблагоприятен, присутствие остатка Gly в P1′, вероятно, придает пептиду необходимую гибкость. для глубокого закрепления соседнего гидрофобного остатка P2′ (рис. 4). Таким образом, ряд остатков, таких как His, Lys, Asn, Gln, Arg или Ser, могут быть размещены на P1’ с хорошей активностью циклизации (Hemu et al., 2019). Напротив, такие остатки, как Ile, Val, Tyr или Trp, могут вводить неблагоприятные гидрофобные взаимодействия в основном с полярной поверхностью лигазы VyPAL2 в этом месте.

На неосновной стороне остатки Asp48 P2 и Asp47 P3 имеют соответствующие площади скрытой поверхности 83 Å 2 и 72 Å 2 при комплексообразовании. Боковая цепь Asp48 (P2) также направлена ​​в сторону от бороздки, связывающей лигазу, что позволяет предположить, что многие остатки могут быть размещены в этом положении (рис. 4), в то время как карбоксилатная группа Asp47 (P3) образует солевой мостик с гуанидиновой группой Arg69. (Рисунок 4).Карбонил основной цепи Asp48 в положении P2 вовлечен в водородную связь с имидазольной группой каталитического His172. Он также взаимодействует с остатком P1’ субстрата через водородную связь между соответствующими боковыми цепями Asp48 и Ser50.

Таким образом, картина распознавания, обнаруженная данным комплексом, предполагает только два основных закрепляющих остатка в P1 и P2′ с ограниченной специфичностью, в то время как P1′ и P3 допускают большее количество вариаций последовательности, и никаких ограничений по последовательности для P2 и остатков за его пределами. П3′.Это в значительной степени объясняет эффективность, с которой Asn лигаза, такая как бутелаза 1 или VyPAL2, может приспосабливаться к большому разнообразию объемных белковых субстратов в качестве лигандов и даже может выполнять белок-белковое лигирование или циклизацию белка.

Остаток «привратник» индуцирует сдвиг в положении субстрата в непервичном сайте

Ранее наблюдалась мутация остатка Cys (Cys247) рядом с активным сайтом OaAEP1b (код доступа PDB: 5H0I) до более крупные аминокислоты (Thr, Met, Val, Leu, Ile) снижали каталитическую эффективность лигирования, в то время как мутации в более мелкие остатки, такие как Ala, приводили к более чем стократному повышению эффективности лигирования.Более того, мутация этого остатка «привратника» в Gly приводит к увеличению количества продукта гидролиза, что позволяет предположить, что остатки в этом сайте играют важную роль в модуляции функции фермента (Yang et al., 2017). Интересно, что МД-моделирование предполагает смещение положения N-концевой (нештриховой) части субстрата из-за стерических затруднений, вызванных остатком привратника, выпячивающимся на поверхности кармана, связывающего субстрат S2 (Hemu et al., 2019). Здесь экспериментальная структура комплекса лигаза-пептид подтверждает и расширяет эту гипотезу: несмотря на превосходное перекрывание субстрата в положении P1 между VyPAL2-C214A формы I (данная работа) и AtLEGγ, ковалентно связанным с Ac-YVAD-cmk (доступ PDB код: 5OBT), изменение положения остатков P2-P3 субстрата происходит в присутствии выступающей боковой цепи в положении привратника (рис. 5; дополнительная фигура 6): в присутствии Ile244 в качестве привратника остатки P2-P3 выталкиваются примерно на 4 Å от поверхности активного центра лигазы по сравнению с положением, принятым, когда привратником является Gly, что позволяет пептидному субстрату приблизиться к поверхности фермента.В результате образуется водородная связь между карбонильным кислородом основной цепи остатка P2 субстрата (Asp48) и имидазольным кольцом каталитического His172 (рис. 5А). Эта водородная связь возможна при принятой в экспериментальной структуре ориентации гистидинимидазольного кольца с атомом Nε, ориентированным к субстрату. И наоборот, переориентация боковой цепи гистидина в сторону каталитического цистеина, как видно в структурах AEP, позволяет активировать атакующую молекулу воды (рис. 5B; дополнительная рис. 6).Актуальность этих наблюдений для активности лигирования была затем проверена с использованием моделирования MD.

Рисунок 6.

His172 представляет собой каталитический остаток, необходимый для активации профермента VyPAL2. (A) Схематическое изображение последовательности VyPAL2-h272A. Продукты обработки профермента при низком pH анализировали с помощью SDS-PAGE (правая панель) с окрашиванием кумасси синим. Инкубация VyPAL2-h272A в течение до 2 часов не приводила к процессуированному ферменту. (B) Предлагаемый механизм процессинга VyPAL2, который не зависит от Cys214 и где His172 является основным каталитическим остатком.Этот механизм включает образование промежуточного соединения ацилимидазола, которое очень нестабильно и быстро расщепляется при атаке нуклеофильной молекулы воды.

Мы представили два комплекса фермент-субстрат для моделирования молекулярной динамики. Комплексы фермент-субстрат были сформированы с использованием остатков 53-328 структуры VyPAL2-C214A в качестве фермента и остатков 43-51 из соседней асимметричной молекулы в качестве субстрата. Аналогичным образом была создана вторая модель, в которой остаток Ile244 был заменен с помощью вычислений на Gly244.Оба фермент-субстратных комплекса моделировались в течение 10 нс. В моделировании MD наиболее заметным последствием мутации I224G является переворот имидазольного кольца боковой цепи His172, который происходит быстро (после 1 нс моделирования) (рис. 5C). Это движение приводит к тому, что каталитическая боковая цепь гистидина принимает конформацию, наблюдаемую в структурах AEP, для остальной части моделирования (рис. 5D). Вследствие этого переворота водородная связь между карбонильным кислородом остатка субстрата Р2 (Asp48) и имидазольным кольцом каталитического His172 теряется.Расстояние между двумя частями быстро увеличивается выше 5 Å и стабилизируется на этом уровне в случае мутанта VyPAL2-I244G (рис. 5D). Это контрастирует с MD-моделированием структуры Ile244, которое показывает очень мало изменений для всего моделирования. Как конформация гистидиновой боковой цепи, так и карбонильное расстояние Asp48 до Nε стабильны, что обеспечивает стабильное образование водородной связи. Таким образом, наличие остатка Gly в позиции привратника способствует расположению каталитического His таким образом, что он может легко активировать входящую молекулу воды для гидролиза, в то время как более объемный остаток, такой как Ile, приводит к образованию водородной связи тот же гистидин с субстратом, который вреден для гидролиза и способствует лигированию.

VyPAL2 может быть автоактивирован исключительно за счет своего каталитического гистидина

PAL и AEP естественным образом экспрессируются в виде проферментов, которым требуется активация, чтобы открыть их активный центр для белковых и пептидных субстратов. Стадии активации состоят из последовательных событий гидролиза, нацеленных на N-концевой пропептид из примерно 50 остатков и С-концевой кэп-домен (~150 остатков). Автоактивация AEP и PAL представляет собой реакцию протеолиза независимо от основной активности (протеазы или лигазы) зрелого фермента.Принято считать, что механизм аутоактивации включает нуклеофильную атаку каталитического цистеина на карбонил пептида по остаткам Asn и/или Asp в N-концевой и линкерной областях профермента. В этом свете способность VyPAL2-C214A эффективно самоактивироваться при кислом pH была довольно неожиданной, поскольку в нем отсутствует каталитический цистеин для осуществления нуклеофильной атаки. Для дальнейшего изучения механизма автоактивации мы создали единственный мутант VyPAL2, имеющий каталитический гистидин, мутировавший в аланин.Мутант VyPAL2-h272A был неспособен к самоактивации (фиг. 6A), так как не наблюдалось полосы более низкой кажущейся молекулярной массы и не происходило снижения профермента во время анализа. Этот результат может указывать на альтернативный путь автоактивации VyPAL2 в отсутствие каталитического Cys214. Этот путь будет зависеть исключительно от His172 и не будет связан с активностью зрелого белка, будь то лигирование или гидролиз. Действительно, мы не наблюдали какой-либо значительной активности процессированного мутанта VyPAL2-C214A в анализах гидролиза или лигирования ни при нейтральном, ни при кислом рН.

При подкислении многочисленные взаимодействия между заряженными остатками на границе между сердцевинным и кэп-доменами нарушаются, что приводит к образованию промежуточной структуры с двумя доменами, соединенными линкерной областью (Фильм S1). Затем следует протеолиз нескольких остатков Asx, легко доступных в линкерном домене. Здесь, в случае VyPAL2, три основных сайта активации были обнаружены в N-концевом пропептиде и один в линкерной области (рис. 1 и 2). Наши результаты показывают, что частичная активация фермента может происходить без образования промежуточного соединения S-ацилфермента: мутант VyPAL2-C214A может быстро расщеплять кэп-домен, в то время как полный процессинг, включая протеолиз N-концевого пропептида, происходит только после нескольких недель инкубации. (Рисунок 1 и форма II кристаллов VyPAL2-C214A).Аналогичное наблюдение ранее было сделано для легумаина, у которого его каталитический Cys мутировал в Ala, который также был способен подвергаться активации (Zhao et al., 2014). Интересно, что, хотя мутант VyPAL2-C214A может очень эффективно осуществлять аутопротеолиз, он не проявляет никакой гидролитической активности при кислом рН с использованием стандартного пептида (GN14: GISTKSIPPISYRNSL (Hemu et al., 2019)) в качестве субстрата, что также справедливо для VyPAL2. Напротив, присутствие каталитического His172 абсолютно необходимо для автоактивации, поскольку VyPAL2-h272A не может быть активирован.

ОБСУЖДЕНИЕ

Протеазы и лигазы имеют высокую аминокислотную последовательность и структурную идентичность. PAL могли дивергентно развиться из AEP, чтобы катализировать реакции транспептидации или лигирования, необходимые для производства циклических пептидов в растениях в качестве механизма защиты от патогенов. На молекулярном уровне природа этой эволюции была недавно прояснена с характеристикой концепций остатка привратника и детерминантов активности лигазы (LAD). Это представление предполагает, что только несколько специфических положений в сайте связывания субстрата достаточны для превращения AEP в PAL.В этой работе мы раскрыли возможный молекулярный механизм, объясняющий основную роль остатка Gatekeeper в определении направления активности фермента.

Реакции лигирования или гидролиза, по-видимому, протекают через две общие начальные стадии: (i) связывание субстрата и нуклеофильная атака сульфгидрильной группой Cys на карбонил P1 (рис. 3C) приводит к образованию промежуточного соединения ацил-фермент и расщеплению Пептидная связь P1-P1′ (ii) нуклеофильная атака на это промежуточное соединение ацил-фермент разрушает временную тиоэфирную связь, образованную между каталитическим цистеином и остатком P1 Asx.Основное различие между лигированием и гидролизом заключается в выборе входящей нуклеофильной группы для разделения промежуточного соединения ацил-фермент: либо молекула воды для протеолиза, либо амин из входящего пептида для лигирования. Эта предложенная общая схема согласуется с элегантными измерениями O-обмена D 2 , которые продемонстрировали отсутствие изотопного сдвига в циклотидном пептиде калата B1, полученном в результате реакции циклизации пептида, что исключает роль молекулы воды в реакции лигирования, осуществляемой OaAEP1b (Харрис и др., 2015) и отдавая предпочтение схеме, в которой прямой аминолиз и транспептидация осуществляются поступающим амином (Hemu et al., 2019).

PAL и AEP имеют почти идентичную структуру, а тонкие различия в их областях LAD1 и LAD2 играют ключевую роль в определении направления реакции (Hemu et al., 2019). Было показано, что область LAD2, расположенная на праймированной стороне сайта связывания пептида, изменяет предпочтение фермента: негидрофобные остатки в LAD2 благоприятствуют присутствию молекул воды, в то время как объемные остатки имеют тенденцию исключать входящий пептид.Например, мутации Y168A, нацеленной на LAD2, было достаточно, чтобы наделить протеазы VyPAL3 и VcAEP значительной пептидциклазной активностью18. И наоборот, небольшой открытый гидрофобный остаток, такой как аланин, в этом положении будет способствовать лигированию, поскольку его гидрофобность снизит локальное сродство к молекулам воды из растворителя, в то время как его небольшой размер может легко вместить входящий пептид (дополнительная фигура 7). Здесь, как видно из комплекса формы I, VyPAL2 обладает Ala174-Pro175-Gly176 в области LAD2, которые сохраняют локальную вторичную структуру белка (β-поворот) и имеют необходимый размер и гидрофобность для связывания Ile51 в качестве P2′. поступающего пептида.

Другой ключевой детерминант активности лежит в остатке Gatekeeper, расположенном в центре LAD1 на стороне сайта связывания, отличной от первичной. В комплексе VyPAL2-C214A форма I гейткипер (Ile244) и каталитический His172 расположены на противоположных сторонах бороздки для связывания пептидов. Алифатическая боковая цепь Ile244 находится на ван-дер-ваальсовом контактном расстоянии 3,3 Å от α-углеродного остатка P2 (Asp48) пептидного лиганда (рис. 3). Сравнение с ферментами, имеющими остаток Gly в качестве привратника, такой как AtLEGγ, ковалентно связанный с Ac-YVAD-cmk, показывает, что соответствующие остатки P2-P3 смещены примерно на 4 Å от активного сайта лигазы (рис. 5; дополнительная фигура 6).В результате смещение, вызванное алифатической боковой цепью в качестве привратника, позволяет образовать водородную связь между карбонильным кислородом остатка субстрата P2 (Asp48) и имидазольным кольцом каталитического His172 (рис. 5). Напротив, когда гейткипером является глицин, соответствующее расстояние слишком велико для установления водородной связи (рис. 5B–5D). Соответственно, эта водородная связь не наблюдается в других структурах активной формы протеазы. Таким образом, настоящая ориентация имидазольного кольца His172, ограниченная этим полярным взаимодействием с пептидом, кажется несовместимой с ролью в активации входящей молекулы воды для нуклеофильной атаки и, по-видимому, является уникальной особенностью лигазы (Movie S2).И наоборот, в AEP каталитический гистидин может действовать как основание, помогая активировать молекулу воды, расположенную над Gly173 в VyPAL2 (соответствует Gly178 в случае AtLEGγ для нуклеофильной атаки тиоэфирной связи. Мы предлагаем что это тонкое изменение конформации пептидного субстрата, вызванное боковой цепью привратника, объясняет, почему PAL способствуют нуклеофильной атаке аминогруппой входящего пептида и почему при более кислом pH реакция лигирования становится менее предпочтительной из-за протонирования входящая аминогруппа.

Наши результаты показали, что аутоактивация может осуществляться без присутствия каталитического Cys, в то время как каталитический His необходим (рис. 2A и 6A), предполагая, что между аутоактивацией и пептидным механизмом действует другой молекулярный механизм гидролиз/лигирование. На основании наших результатов мы предложили механизм автоактивации VyPAL2-C214A. При рН активации His172 и Asn67, вероятно, действуют как каталитическая диада. Азот имидазола His172 действует как нуклеофил, атакуя и расщепляя расщепляющуюся связь P1-P1’, образуя ацилимидазольный промежуточный продукт.Поскольку протоны постоянно поглощаются и возвращаются окружающим молекулам воды-растворителя вблизи каталитического центра, после образования промежуточного соединения ацилимидазол может быстро гидролизоваться (рис. 6В). Действительно, при кислом рН 4-5 имидазол каталитического гистидинового остатка может выступать как в роли кислоты, так и основания. Следовательно, возможно, что один из атомов азота имидазола His172 в мутанте VyPAL2-C214A может служить нуклеофилом для атаки карбонильного углерода разрывающейся пептидной связи с образованием промежуточного соединения ацилимидазола, которое очень нестабильно и подвергается быстрому гидролизу. .Амидные атомы водорода Gly173 и Ala214 образуют водородные связи с карбонильным кислородом разрезаемой пептидной связи. Те же водородные связи все еще могут образовываться с оксианионом для его стабилизации, что имеет решающее значение для образования промежуточного соединения ацил-фермент, поскольку первая стадия этого механизма имеет самую высокую энергию активации и, следовательно, является стадией, определяющей скорость.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мы обнаружили, что N-конец VyPAL2-C214A, содержащий последовательность Asp49-Ser50-Ile51, представляет собой субстратный протеолитический мотив P1P1’P2′, что позволяет нам провести подробный структурный анализ карманов активного сайта фермента. которые используются как для протеазной, так и для лигазной активности.В этом отношении пептидные аспарагиниллигазы кажутся условно-патогенными катализаторами, которые произошли от аспарагинилэндопротеаз: путем повторного использования по существу того же сайта связывания с введением лишь нескольких ключевых остатков вблизи консервативного кармана S1. Небольшого искажения, вызванного конформацией пептида-субстрата, оказывается достаточно, чтобы наделить тот же самый каталитический центр новой активностью. Это двойное использование карманов специфичности также отражается в том, как мы можем интерпретировать существующую кристаллическую структуру формы I: комплекс можно рассматривать либо как комплекс профермент-субстрат, либо, альтернативно, как комплекс лигаза-продукт.В первом случае профермент захватывается в акте расщепления транс-конца N-конца молекулы-компаньона для созревания, в то время как во втором лигаза только что провела реакцию лигирования белок-пептид с использованием Asp в качестве остатка P1.

МЕТОДЫ

Экспрессия белка и автоактивация

Экспрессию и очистку VyPAL2 и различных мутантов проводили, как описано ранее (Hemu et al., 2019). Вскоре после мутагенеза гены, кодирующие VyPAL и его мутанты, экспрессировали в клетках насекомых Sf9 с использованием протокола Bac-to-Bac (Invitrogen).Очистку белков проводили в три этапа с аффинной очисткой IMAC с последующей ионообменной и эксклюзионной хроматографией (SEC, с 1x PBS, pH 7,4, 1 мМ DTT). Затем белок концентрировали и хранили при 4°С.

После гель-фильтрации проферменты концентрировали до 2 мг/мл. Оптимальное время активации было оценено после временного анализа. Зимогены активировали при 37°С в 50 мМ цитрате, 100 мМ NaCl в объемном соотношении 1:1 (об./об.) с добавлением 0.5 мМ N-лаурокриозин, 1 мМ ДТТ, конечный рН 4,4. Образцы проверяли с помощью SDS-PAGE для определения оптимального времени активации. После увеличенной активации профермента активационную смесь подвергали очистке SEC с использованием буфера, содержащего 20 мМ MES, pH 6,5, 0,1 M NaCl, 1 мM DTT. Фракции, содержащие белок в активной форме, объединяли и концентрировали для дальнейшего использования.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Активные ферменты концентрировали до 4-9 мг/мл и подвергали скринингу с использованием набора для скрининга JCSG-plus HT-96 (Molecular Dimensions).Кристаллы были получены для активной формы VyPAL2 (6,7 мг/мл): 0,1 М ацетат натрия, рН 4, 0,2 М сульфат лития, 30% ПЭГ 8000; VyPAL2-I244V (10,4 мг/мл): 0,1 м бис-трис, pH=7,5, 25% (мас./об.) ПЭГ 3350; VyPAL2-C214A (форма I, 4,93 мг/мл): 0,2 М сульфата лития, 0,1 М ацетата натрия, 30% (вес/объем) ПЭГ 8000, рН=4,6, и для VyPAL2-C214A (форма II, 9,14 мг/мл): 0,2 М формиат калия, 20% (масса/объем) ПЭГ 3350. Кристаллы, пригодные для сбора рентгеновских данных, замораживали в жидком азоте с добавлением 20% (масса/объем) глицерина и отправляли на синхротрон для сбора данных.Данные были интегрированы с использованием XDS (Kabsch, 2010), а структуры были решены с использованием 6IDV в качестве модели в Phaser (CCP4) (Winn et al., 2011). Ручную коррекцию структур выполняли в программе Coot для молекулярной графики (Emsley et al., 2010) и уточняли с помощью Buster TNT (GlobalPhasing Ltd) (Smart et al., 2012). Статистика обработки и уточнения представлена ​​в дополнительной таблице 1. Структуры были депонированы в Банк данных белков.

Кинетические исследования

Субстратные пептиды были синтезированы компанией Bio Basic и состоят из N-концевого субстрата PIE(EDANS)YNAL и С-концевого субстрата GIK(DABSYL)SIP.Анализы лигирования проводили в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мкл буфера MES (20 мМ MES, pH 6,5, 0,1 М NaCl, 1 мМ DTT), 20 мкл серийных разведений (с буфером MES) субстратов, содержащих как N-, так и С-концевые субстраты в соотношении (EDANS:DABSYL) 1:3. Конечные концентрации субстрата EDANS составляли 50 мкМ, 25 мкМ, 12,5 мкМ, 6,25 мкМ, 3,125 мкМ, 1,5625 мкМ и 0,78125 мкМ. Фермент вводили непосредственно перед измерением инжектором микропланшет-ридера Tecan 10M Spark; Добавляли 20 мкл фермента в концентрации 100 нМ для получения конечной концентрации 20 нМ.Реакции проводили при 37 °C в течение 2 минут и измеряли с интервалом в 5 секунд для расчета начальных скоростей на линейной части кривой прогресса. Все образцы были добавлены в планшет Thermo Fisher Scientific-Nunclon 96 Flat Black, и флуоресценция была измерена с помощью считывателя микропланшетов Tecan 10M Spark с длиной волны возбуждения 336 нм и длиной волны испускания 490 нм.

Моделирование молекулярной динамики

Для получения уравновешенного положения субстрата комплексы фермент-субстрат подвергали моделированию молекулярной динамики на NAMD 2.12.3 (Филлипс и др., 2016). Комплексы образуются при использовании остатков 43-51 из соседнего домена в качестве субстрата и остатков 52-326 в качестве корового домена. Комплексы моделировали в водяном ящике, где минимальное расстояние между растворенным веществом и границей ящика составляло 15 Å по всем трем осям. Заряды сольватированной системы нейтрализовали противоионами, а ионную силу растворителя доводили до 150 мМ NaCl с помощью VMD.4 (Humphrey et al., 1996). Полностью сольватированную систему подвергали минимизации сопряженного градиента в течение 10 000 шагов, а затем нагревали до 310 К с шагом 5 пс.Систему моделировали в течение 20 нс с фиксированными в пространстве атомами Ca Asp49 пептидного субстрата и атомами скелета лигазы, ограниченными гармоническим потенциалом вида U(x)=k(x-xref)2, где k составляет 1 ккал моль-1 Å-2, а xref – начальные координаты атома. Кроме того, расстояние между атомом Sγ Cys214 и атомом C основной цепи Asp49 поддерживается на уровне 2,94 Å при гармоническом потенциале. Такие ограничения позволяют боковым цепям ферментов и остальной части пептидного субстрата свободно перемещаться.Все симуляции были выполнены в ансамбле NPT, предполагая силовое поле CHARMM36 для белка 5 и предполагая модель TIP3P для молекул воды (Best et al., 2012). Моделирование МД проводилось на ASPIRE-1 Национального суперкомпьютерного центра Сингапура (https://www.nscc.sg).

Дополнительные данные

Дополнительная таблица 1 . Сбор данных и уточнение статистики.

Дополнительная таблица 2 R.M.S.D. Vy PAL2 с другими заводскими АЭП (PDBeFold).

Дополнительный рисунок 1 . Профили SEC VyPAL2 wt и I244V.

Дополнительный рисунок 2 . Электростатические заряды на молекулярном интерфейсе зрелого активного домена Vy PAL2 и кэп-области.

Дополнительный рисунок 3 . Сравнение кинетики активации между VyPAL2 и VyPAL2-C214A.

Дополнительный рисунок 4 . Сравнение активных структур VyPAL2 и его мутантов.

Дополнительный рисунок 5 .Положение кэп-домена профермента Gln343 и активной формы VyPAL2-C214 Asp49.

Дополнительный рисунок 6 . Влияние остатка LAD1 «Gatekeeper» на молекулярную поверхность Vy PAL2.

Дополнительный рисунок 7 . Эффект присутствия большого объемного остатка в области LAD2.

Дополнительный фильм 1 . Активация VyPAL2.

Дополнительный фильм 2 . Сравнение структуры между VyPAL2-C214A Form I и AtLEGγ, связанным с Ac-YVAD-cmk.

БЛАГОДАРНОСТИ

Это исследование было поддержано Грантом на академические исследования уровня 3 (MOE2016-T3-1-003) от Министерства образования Сингапура (MOE) для лабораторий JL, JPT и CFL. Мы благодарим за их квалифицированную помощь ученых и персонал на линии пучка (i) на синхротроне Spring-8, где была собрана структура активного фермента VyPAL2, (ii) на Swiss Light Source (SLS), где была собрана форма II VyPAL2-C214A, и (iii) на MX2 ( Австралийский синхротрон), где были собраны наборы данных VyPAL2-C214A form I и VyPAL2-I244V.Мы благодарим Национальный суперкомпьютерный центр Сингапура (https://www.nscc.sg) за предоставление ASPIRE-1 для моделирования МД.

**************************************************** **************************** ********** ОТЧЕТ ОБ АНАЛИЗАХ БЕЛКА по программе ЧТО ЕСЛИ ********** ******************************************************* ********************** Дата : 2020-08-09 Этот отчет был создан программой WHAT IF версии WHATCHECK15.0. Этот документ представляет собой отчет WHAT_CHECK 14.0 для PDB-файла.Каждый сообщил факт имеет назначенную серьезность, одну из: error : Элементы, помеченные как ошибки, считаются серьезными проблемами, требующими немедленное внимание. предупреждение: Либо менее серьезные проблемы, либо необычные структурные особенности. Эти по-прежнему требуют особого внимания. примечание: Статистические значения, графики или другие подробные результаты тестов и анализы, которые были выполнены. Если присутствуют альтернативные конформации, оценивается только первая. Водород атомы включаются только в том случае, если это явно запрошено, и даже тогда они не используется во всех проверках.Программное обеспечение хуже работает с неканоническими амино. кислот и экзотических лигандов, чем для 20 канонических остатков и канонических нуклеиновые кислоты. Некоторые замечания относительно вывода: Остатки/атомы в таблицах обычно даются в нескольких частях: Число. Это внутренний порядковый номер остатка, используемого ЧТО ЕСЛИ. Первые остатки в файле получают номера 1, 2 и т.д. Тип остатка. Обычно это трехбуквенный тип аминокислоты. Порядковый номер в скобках. Это остаточный номер, как это было данные во входном файле.За ним может следовать код вставки. Идентификатор цепочки. Один персонаж. Если в входного файла, это будет знак минус или пробел. Номер модели. Если номера модели не существует, как в большинстве рентгеновских файлов, это быть пробелом или иногда знаком минус. Если атом является частью вывода, атом будет указан с использованием PDB. номенклатура для типа и идентификатора. Чтобы указать нормальность оценки, оценка может быть выражена как Z-значение. или Z-оценка.Это просто количество стандартных отклонений, которое дает оценка отклоняется от ожидаемого значения. Свойство Z-значений состоит в том, что ожидается, что среднеквадратичное значение группы Z-значений (среднеквадратичное Z-значение) будет 1.0. Значения Z выше 4,0 и ниже -4,0 очень редки. Если Z-оценка используется в ЧТО ЕСЛИ, сопровождающий текст поясняет, как ожидаемое значение и стандартное отклонение были получены. Названия нуклеиновых кислот: DGUA, DTHY, OCYT, OADE и др. Первый символ представляет собой D или O для ДНК или РНК соответственно.Это позволяет избежать двусмысленности в многие старые файлы PDB, в которых ДНК и РНК назывались A, C, G и T. ========================================= ==== Составной код /zata/tempdir/2gnd/wctemp_0cyc/2gnd_0cyc.pdb ==== ========================================= # 1 # Примечание: Введение WHAT CHECK должен прочитать файл PDB, прежде чем он сможет его проверить. Это делает серия проверок при чтении файла. Результаты этих проверок сообщается в этом разделе (раздел 2.1). Остальное в отчете будет больше систематически в этом разделе 2.2 отчета по административным проблемам. Раздел 2.3 дает описательный вывод, который не подтверждает вещи напрямую, а больше рассказывая вам, как WHAT CHECK интерпретировал входной файл. Раздел 2.4 смотрит на B-факторы, занятость и наличие/отсутствие (ложных) атомы. Раздел 2.5 посвящен проблемам номенклатуры. Раздел 2.6 касается геометрические задачи, такие как длины связей и валентные углы. Раздел 2.7 касается проблемы с углом кручения. В разделе 2.8 рассматриваются атомные столкновения. Раздел 2.9 касается с упаковкой, доступностью и т.д.Раздел 2.10 посвящен водороду. связи, упаковка ионов и другие вещи, которые можно обобщить под общим Назовите взаимодействие заряд-заряд. В разделе 2.11 дается краткое изложение всего отчета. и сообщает вам (если применимо), какие матрицы симметрии использовались. Раздел 2.12 сообщает кристаллографу, какие вещи больше всего нуждаются в ручном коррекция. И последний раздел, раздел 2.13, перечисляет все отсортированные остатки необходимостью их визуального осмотра в свете плотности электронов. # 2 # Примечание: записи заголовков из файла PDB Записи заголовка из файла PDB.ЗАГОЛОВОК САХАРСВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК 10-АПРЕЛЯ-06 2GND ОДИН ЧАС ЛЕЧЕНИЯ ЭДТА, P. ANGOLENSIS LECTIN # 3 # Примечание: График RMS некристаллографической симметрии На графике показаны различия RMS между двумя аналогичными цепями на остатке. по остатку. Отдельные «всплески» могут свидетельствовать об интересных или неправильные остатки. Если все остатки показывают высокое среднеквадратичное значение, структура может быть неправильно уточнены. В файле TeX сюда вставлен график Идентификаторы цепей двух цепочек: A и B All-Atom RMS подходит для двух цепей: 0.482 Среднеквадратичное значение только для CA подходит для двух цепей: 0,257 # 4 # Примечание: график разности остова некристаллографической симметрии На графике показаны различия в углах кручения позвоночника между двумя подобные цепи по остатку. Отдельные «шипы» могут быть указывает на интересные или неправильные остатки. Если все остатки показывают высокое различия, структура могла быть неправильно уточнена. В файле TeX сюда вставлен график Идентификаторы цепей двух цепочек: A и B # 5 # Предупреждение: обнаружена проблема при подсчете молекул и матриц Параметр Z, указанный на карте CRYST, представляет молекулярную кратность в кристаллографической ячейке.Обычно Z равно количеству матрицы пространственной группы, умноженные на количество отношений NCS. значение Z умножается на интегрированную молекулярную массу молекул в файле для определения коэффициента Мэтьюза. Это отношение находится проверено в этом варианте. Имейте в виду, что проверка может запутаться, если в записях ATOM присутствуют как множественные копии молекулы, так и Записи MTRIX присутствуют в заголовке файла PDB. Пространственная группа, считанная с карты CRYST: P 21 21 21 Количество матриц в космической группе: 4 Наибольшая кратность полимерных цепей в структуре: 2 Самая высокая кратность полимерной цепи согласно SEQRES: 2 Во входном файле не найдены явные матрицы MTRIX NCS. Значение Z на карте CRYST1: 0 Матрицы БИОМТ были найдены, но недостаточно, чтобы объяснить разницу # 6 # Ошибка: коэффициент Мэтьюза (Vm) очень высокий Коэффициент Мэтьюза [REF] определяется как плотность белка структура в кубических ангстремах на дальтон.Нормальные значения находятся в пределах 1,5 (плотно упаковано, мало места для растворителя) и 4,0 (неплотно упаковано, много место для растворителя). Некоторые очень слабо упакованные структуры могут немного получать значения. выше этого. Такие высокие числа почти всегда вызваны неверным значением Z. на карте CRYST1 (или вообще не указывая этот номер). Молекулярная масса всех полимерных цепей: 52681,465. Объем элементарной ячейки V= 585053,125 Кратность космической группы: 4 Матрицы симметрии NCS (записи MTRIX) не найдены в файле PDB Коэффициент Мэтьюза для наблюдаемых атомов и Z высок: Vm= 22.211 Имейте в виду, однако, что количество остатков с отсутствующими атомами составляет: 19 В файле PDB наблюдается одна матрица БИОМТ, но она единая. Коэффициент Мэтьюза из ЗАМЕЧАНИЯ 280 Vm= 2,650 Vm авторов и этот рассчитанный Vm не очень хорошо согласуются # 7 # Примечание: Z отсутствует на карте CRYST1 Сообщения выше, вероятно, вызваны тем фактом, что Z отсутствует в карта КРИСТ1. # 8 # Примечание: Все атомы находятся достаточно далеко от осей симметрии Ни один из атомов в структуре не находится ближе 0.77 Ангстрем в правильном направлении ось симметрии. # 9 # Примечание: Идентификаторы цепочек ОК WHAT CHECK не обнаружил серьезных проблем с идентификатором цепи. Но будь известно, что WHAT CHECK не заботится о цепочке идентификаторов вод. # 10 # Предупреждение: лиганды, для которых автоматически сгенерирована топология Топология лигандов в таблице ниже была определена автоматически. WHAT CHECK использует локальную копию библиотеки мономеров CCP4 для генерировать информацию о топологии для лигандов. Имейте в виду, что автоматическая топология Генерация — сложная задача.Итак, если вы получаете сообщения, которые не можете понимаете или считаете неправильным, и один из этих лигандов вовлечены, затем сначала проверьте запись топологии лиганда. Эта топология либо присутствует в библиотеке мономеров или в виде файла, сгенерированного libcheck, в локальном каталог. 482 ММА ( 1-) К — 483 ЧЕЛОВЕК ( 2-) С — 486 ЧЕЛОВЕК ( 253- ) Б — # 11 # Внимание: ковалентно связанные лиганды Лиганды в этой таблице ковалентно связаны с чем-то другим. это уже трудно автоматически генерировать топологии для лигандов, но когда они ковалентно связаны с чем-то, это становится еще более сложно сделать все правильно.Итак, если вы получаете странные сообщения об ошибках которые кажутся связанными с этой ковалентной связью, то, пожалуйста, не стесняйтесь игнорировать их или, что еще лучше, сделать запись топологии вручную. Комментарий «Другой лиганд» указывает на то, что ковалентная связь связана с другим лигандом. лиганд. В этом случае вы можете захотеть преобразовать два лиганда в один. больший лиганд. 482 ММА ( 1-) C — Другой лиганд 483 MAN ( 2-) C — Другой лиганд #12# Примечание: странных межцепных соединений не обнаружено Ковалентные связи между молекулами с неидентичными идентификаторы цепочки.# 13 # Примечание: в лигандах не должно быть повторяющихся имен атомов. Все имена атомов в лигандах (если они есть) кажутся достаточно уникальными. # 14 # Примечание: во всех случаях использовался первичный альтернативный атом WHAT CHECK не увидел необходимости делать какие-либо поправки на альтернативные атомы (что означает они либо все правильные, либо их нет). # 15 # Примечание: остатков внутри лигандов не обнаружено Либо эта структура не содержит лигандов с аминокислотными группами внутри это, или их наименование является правильным (достаточно). # 16 # Примечание. Никакие присоединенные группы не мешают расчетам водородных связей. Вроде нет сахаров, липидов и т.д., связанные (или очень близкие) к атомам которые в противном случае могли бы образовывать водородные связи. # 17 # Примечание: не обнаружено вероятных атомов боковой цепи с нулевой заселенностью. Либо нет атомов боковой цепи с нулевой заселенностью, либо боковая цепь атомы с нулевой заселенностью не присутствовали во входном файле PDB (в котором если они перечислены как отсутствующие атомы), или их положения достаточно маловероятно гарантировать нулевую заполняемость. # 18 # Примечание: Вероятных атомов основной цепи с нулевой заселенностью не обнаружено. Либо нет атомов скелета с нулевой заселенностью, либо скелет атомы с нулевой заселенностью были исключены из входного PDB-файла (в в этом случае они перечислены как отсутствующие атомы), или их положения достаточно маловероятно, чтобы гарантировать нулевую занятость.#19# Примечание: Все остатки имеют полный костяк. Ни один остаток не имеет отсутствующих атомов основной цепи. # 20 # Примечание: нет остатков только C-альфа Не существует остатков, состоящих только из альфа-атома углерода. ******************************************************* ******************** *** *** *** ПЕРЕЙТИ НА 012 *** *** *** ******************************************************* ******************** # 21 # Предупреждение: неканонические остатки Неканонические остатки WHAT CHECK обнаружил любые неканонические остатки.Если они перечислены здесь как ОК, то КАКАЯ ПРОВЕРКА разумна относительно топологии, которую он определил. Если остаток помечен как HARD, то было сложно составить топологию, и вы могли хочу быть критичным, когда дело доходит до сообщений об ошибках, связанных с этим остатком. 1 ПСА ( 1-) А — ОК 242 ПСА ( 1-) В — ОК # 22 # Примечание: Содержимое PDB-файла в интерпретации WHAT CHECK Содержимое файла PDB, интерпретируемое WHAT CHECK. WHAT CHECK прочитал ваш файл PDB и сохранил его внутри так называемого ‘суп’.Состав этого супа указан здесь. Подробное объяснение всех часто используемых выходных форматов WHAT CHECK можно найти по адресу swift.cmbi.ru.nl. Посмотрите в выходных форматах. Курс по чтению этого Таблица «Молекулы» является частью веб-сайта WHAT CHECK. 1 1 ( 1) 241 ( 241) Белок /zata/tempdir/2gn… 2 242 ( 1) 481 ( 240) B Белок /zata/tempdir/2gn… 3 482 ( 1) 482 ( 1) C MMA 222 GLN ( 222-) A — NE2 0,29 2,56 INTRA BF 194 АРГ ( 194-) А — НЕ 196 ГЛУ ( 196-) А — ОЕ2 0.21 2.49 ИНТРА БФ 289 ARG ( 49-) B — Nh3 338 THR ( 98-) B — C 0.17 2.93 INTRA BL 323 ASN ( 83-) B — ND2 462 GLN ( 222-) B — CG 0,16 2,94 INTRA BF 434 ARG ( 194-) B — NE 436 GLU ( 196-) B — OE2 0,15 2,55 INTRA BF 210 ТРП ( 210-) А — СВЭ1 254 АСП ( 14-) Б — ОД2 0,14 2,56 ИНТРА 248 ПНЕ ( 😎 Б — Н 471 ТРП ( 231-) Б — О 0,13 2,57 ВНУТР БЛ 164 ARG ( 164-) A — NE 224 GLN ( 224-) A — NE2 0.10 2,75 ИНТРА 300 GLU ( 60-) B — OE1 303 SER ( 63-) B — CB 0,09 2,71 INTRA BF 177 АСН ( 177-) А — О 181 АРГ ( 181-) А — Н 0,09 2,61 ИНТРА 103 СЭР ( 103-) А — О 109 ГЛИ ( 109-) А — Н 0,08 2,62 ИНТРА 397 ВАЛ ( 157-) Б — Н 398 ЛИС ( 158-) Б — Н 0,07 2,53 ИНТРА БЛ 77 LEU ( 77-) A — O 167 GLY ( 167-) A — N 0,06 2,64 INTRA BL 277 АСП ( 37-) Б — ОД1 279 АСН ( 39-) Б — Н 0.06 2.64 ИНТРА БФ 8 ФЭ ( 😎 А — Н 231 ТРП ( 231-) А — О 0,06 2,64 ИНТРА БЛ И так далее до 32 строк. # 80 # Примечание: некоторые примечания относительно этих ударов Удары были разделены на 5 категорий, начиная от «пожалуйста, посмотрите» до «надо исправить». Кроме того, интегрированная сумма всех ударов, квадрат сумма всех ударов, а эти последние два значения нормализованы по количеству контакты также перечислены для целей сравнения, например, между небольшими и крупные белки.Общее значение удара: 2,294 Общее значение удара на остаток: 0,067 Общее количество ударов: 32 Суммарное квадратичное значение рельефа: 0,303 Общее количество ударов в самой легкой корзине: 31 Общее количество ударов во втором бине: 1 Общее количество ударов в средней корзине: 0 Общее количество ударов в четвертом бине: 0 Общее количество ударов в худшем бине: 0 # 81 # Примечание: проверка внутреннего/внешнего распределения Следующий список содержит Z-значения для каждого остатка, описывающие, насколько хорошо наблюдаемая доступность остатка соответствует ожидаемой.Положительный Z-показатель указывает на «большее воздействие, чем обычно», тогда как отрицательный Z-показатель означает «более похороненный, чем обычно». Абсолютное значение Z-показателя должно использоваться для судить о качестве. СЕГОДНЯ ЧТО ПРОВЕРЯЛ, поводов для жалоб не увидел. # 82 # Примечание: Распределение остатков внутри/снаружи нормальное Распределение типов остатков внутри и снаружи белок в норме. внутри/снаружи RMS Z-оценка: 0,960 # 83 # Примечание. График внутри/вне RMS Z-показателя Среднеквадратичная Z-оценка нормальности внутреннего/внешнего распределения по остатку 15 окно построено как функция остаточного числа.Высокие участки на участке (выше 1,5) указывают на необычные внутренние/внешние узоры. В файле TeX сюда вставлен график Идентификатор цепи: А # 84 # Примечание. График внутри/вне RMS Z-показателя В файле TeX сюда вставлен график Идентификатор цепи: B # 85 # Предупреждение: неправильная среда упаковки для некоторых остатков Остатки, перечисленные в таблице ниже, имеют необычную среду упаковки. Среда упаковки остатков сравнивается со средней упаковкой среду для всех остатков одного типа в хороших файлах PDB.низкий Оценка упаковки может указывать на одну из нескольких вещей: Плохая упаковка, неправильная заправка. последовательности через плотность, кристаллические контакты, контакты с кофактор, или остаток является частью активного центра. Не редкость увидеть некоторые из них, но в любом случае это требует дальнейшего изучения остаток. 384 ТЫР ( 144-) Б — -6,16 81 ЛЕУ ( 81-) А — -5,40 144 ТЫР ( 144-) А — -5,37 395 АРГ ( 155-) Б — -5,25 # 86 # Предупреждение: неправильная среда упаковки для последовательных остатков Растяжка из не менее трех последовательных остатков с сомнительной упаковкой среда была найдена.Это может указывать на то, что эти остатки являются частью странной петли. Это может также свидетельствовать о неправильном написании плотность. Однако это также может указывать на то, что один или несколько остатков в этом растяжения есть и другие проблемы, такие как, например, отсутствующие атомы, очень странные углы или длины связей и т. д. В таблице ниже перечислены первый и последний остаток на каждом найденном участке. а также средний балл остатка серии. 336 АСП ( 96-) Б — 338 — ПТР 98- (Б ) — -4,20 # 87 # Примечание: Конструктивная средняя среда упаковки OK Структурная средняя оценка упаковки находится в пределах нормы.Среднее значение для диапазона 1–480: -0,277 # 88 # Примечание: График значения качества Значение качества, сглаженное по окну с 10 остатками, представлено как функция номера остатка. Низкие области на графике (ниже -2,0) указывают на необычные упаковка. В файле TeX сюда вставлен график Идентификатор цепи: А # 89 # Примечание: График значения качества Значение качества, сглаженное по окну с 10 остатками, представлено как функция номера остатка. Низкие области на графике (ниже -2,0) указывают на необычные упаковка.В файле TeX сюда вставлен график Идентификатор цепи: B # 90 # Предупреждение: низкий Z-показатель упаковки для некоторых остатков Остатки, перечисленные в таблице ниже, имеют необычную упаковку. Окружающая среда в соответствии с проверкой упаковки 2-го поколения. Счет в таблице указана нормальность упаковки. Z-оценка: положительный означает лучше среднего, отрицательный означает хуже среднего. Только остатки с оценками менее -2,50 перечислены здесь. Это необычные остатков в структуре, так что будет интересно взять особый взгляд на них.350 лей ( 110-) Б — -2,60 110 ЛЕУ ( 110-) А — -2,55 # 91 # Предупреждение: Z-значение неправильной упаковки для последовательных остатков Участок из не менее четырех последовательных остатков с насадкой 2-го поколения Был обнаружен Z-показатель ниже -1,75. Это может свидетельствовать о том, что эти остатки часть чужой петли или что остатки в этом диапазоне неполные, но это также может быть признаком неправильной заправки. В таблице ниже перечислены первый и последний остаток на каждом найденном участке. а также средний остаточный Z-показатель серии.105 GLY ( 105-) A — 108 ЛЕУ ( 108-) A — 1,60 # 92 # Примечание: график Z-оценки качества второго поколения Z-оценка качества второго поколения, сглаженная в окне с 10 остатками строится как функция остаточного числа. Низкие участки на участке (ниже -1.3) указывают на необычную упаковку. В файле TeX сюда вставлен график Идентификатор цепи: А # 93 # Примечание. График Z-показателя качества второго поколения В файле TeX сюда вставлен график Идентификатор цепи: B # 94 # Примечание: Условия кристаллизации из REMARK 280 Условия кристаллизации указаны в заголовке файла PDB.КРИСТАЛЛ СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ, ОБ (%): 53,63 КОЭФФИЦИЕНТ МЭТЬЮСА, VM (АНГСТРОМ**3/DA): 2,65 УСЛОВИЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ: 18% ПЭГ8000, 0,2 М АЦЕТАТ КАЛЬЦИЯ, PH 6.5, ДИФФУЗИЯ ПАРА, ВИСЯЩАЯ КАПЛЯ, ТЕМПЕРАТУРА 293K #95# Ошибка: Кластеры воды без контактов с неводными атомами Молекулы воды, перечисленные в таблице ниже, являются частью молекулы воды. скопления, не вступающие в контакт с неводами. Эти молекулы воды часть скоплений, которые имеют расстояние не менее чем на 1 Ангстрем больше, чем сумма ван-дер-ваальсовых радиусов с точностью до ближайшего атома, не являющегося растворителем.Так как такие кластеры воды обычно не наблюдаются при рентгеновской дифракции. их присутствие может указывать на артефакт обработки. Число в скобках — идентификатор молекулы воды во входном файле. 488 НОН ( 309 ) А — О # 96 # Примечание: вода не нуждается в движении Все молекулы воды достаточно близки к асимметричной единице, приведенной на рис. входной файл. #97# Ошибка: Молекулы воды без водородных связей Молекулы воды, перечисленные в таблице ниже, не образуют водородных связей. ни с белком, ни с ДНК/РНК, ни с другими молекулами воды.Это сильный признак проблемы уточнения. 488 НОН ( 309 ) А — О 488 НОН ( 340 ) А — О # 98 # Ошибка: His, Asn, Gln боковая цепь переворачивается Здесь перечислены остатки гистидина, аспарагина или глутамина для что ориентация, определенная из анализа водородных связей, равна отличается от задания, заданного во входных данных. Либо они могли образуют энергетически более выгодные водородные связи, если концевые группа была повернута на 180 градусов, либо в входной файл (тип атома «A»), но можно выполнить присвоение.Имейте в виду, тем не менее, что если топология не может быть определена для одного или нескольких лиганды, то этот вариант будет допускать ошибки. 68 АСН ( 68-) А — 143 АСН ( 143-) А — 224 ГЛН ( 224-) А — 312 ГЛН ( 72-) Б — 408 ГЛН ( 168-) Б — 411 АСН ( 171- ) Б — 422 АСН ( 182- ) Б — 464 ГЛН ( 224-) Б — # 99 # Примечание: присвоение гистидинового типа Для всех полных остатков HIS в структуре предварительное отнесение к HIS-D (протонированный на ND1), HIS-E (протонированный на NE2) или HIS-H (протонированный как на ND1, так и на NE2, положительно заряженные) сделан на основе водородной связи сеть.Второе назначение делается на основе того, какой из Энга и Хубера [REF] гистидиновая геометрия лучше всего соответствует структуре. В таблице ниже перечислены все нормальные остатки гистидина. Назначение на основе геометрии остатка указывается первым вместе со среднеквадратичным значением Z-оценка соответствия параметрам Энга и Хубера. Для всех остатков, где назначение Н-связи другое, назначение указано в последнем столбцы вместе со среднеквадратичной Z-оценкой по параметрам Энга и Хубера. Как всегда, среднеквадратичные Z-показатели должны быть близки к 1.0, если остатки ограничивается параметрами Энга и Хубера при уточнении, а если доступно достаточно данных (с высоким разрешением). Обратите внимание, что из-за различий между геометрией различные типы малы, возможно, что заданное геометрическое задание здесь не соответствует типу, используемому при уточнении. Это особенно верно, если среднеквадратичные Z-показатели намного выше 1,0. Если два задания различаются или среднеквадратичная Z-оценка «геометрии» высока, желательно проверить назначение водородной связи, проверить используемый тип HIS при доработке и, возможно, скорректировать его.57 HIS ( 57-) A — HIS-H 0,06 HIS-E 0,59 146 HIS ( 146-) A — HIS-H 0,10 HIS-D 0,54 226 HIS ( 226-) A — HIS-H 0,11 HIS-D 0,54 297 HIS ( 57-) B — HIS-H 0,10 HIS-E 0,57 386 HIS ( 146-) B — HIS-H 0,05 HIS-D 0,56 466 HIS ( 226-) B — HIS-H 0,09 HIS-D 0,59 # 100 # Предупреждение: Похоронены неудовлетворенные доноры водородных связей Скрытые доноры водородных связей, перечисленные в таблице ниже, имеют водородную атом, не участвующий в водородной связи в оптимизированной водородной связи сеть.Доноры водородных связей, которые скрыты внутри белка, обычно используют все их атомы водорода для образования водородных связей внутри белка. Если есть какие-либо доноры скрытых водородных связей, не связанные водородной связью, в структуре, которую они будут быть перечислены здесь. В очень хороших структурах число перечисленных атомов будет стремиться до нуля. Воды не перечислены этой опцией. 10 ТР ( 10- ) А — Н 17 АСН ( 17-) А — НД2 54 АЛА ( 54-) А — Н 71 СЕР ( 71-) А — ОГ 82 СЕР ( 82- ) А — Н 83 АСН ( 83-) А — НД2 85 АЛА ( 85-) А — Н 138 АСН ( 138-) А — НД2 139 ТР ( 139- ) А — Н 153 СЕР ( 153- ) А — Н 162 ГТР ( 162-) А — СВ1 163 АСП ( 163- ) А — Н 182 АСН ( 182- ) А — Н 191 АСП ( 191- ) А — Н 223 ТЫР ( 223- ) А — Н 250 ТР ( 10-) B — N 257 АСН ( 17-) Б — НД2 294 АЛА ( 54- ) Б — Н 311 СЕР ( 71- ) Б — ОГ 325 АЛА ( 85- ) Б — Н 393 СЕР ( 153- ) Б — Н 402 ГТО ( 162- ) Б — СВ1 463 ТЫР ( 223- ) Б — Н 480 ТПЧ ( 240-) Б — ОГ1 485 ЧЕЛОВЕК ( 253- ) Б — О4 # 101 # Предупреждение: спрятаны неудовлетворенные акцепторы водородных связей Акцепторы водородной связи скрытой боковой цепи, перечисленные в таблице ниже, представляют собой не участвует в водородной связи в оптимизированной сети водородных связей.В норме образуются акцепторы водородных связей боковой цепи, спрятанные внутри белка. водородные связи внутри белка. Если в ней есть не связанные водородом оптимизированная сеть водородных связей они будут перечислены здесь. Воды не перечислены этой опцией. 68 АСН ( 68-) А — ОД1 150 АСП ( 150-) А — ОД2 # 102 # Примечание: некоторые примечания относительно этих доноров и акцепторов Доноры и акцепторы были подсчитаны также в зависимости от их доступность. Захороненные доноры и акцепторы были разделены на пять категории, начиная от не образующих водородной связи и заканчивая образованием плохой до идеальной водородной связи.Очевидно, захороненные доноры и акцепторы без водородной связи или со слабой водородной связью должно вызывать беспокойство. Как каждый белок содержит больше акцепторов, чем доноров, неудовлетворенных доноров больше в нуждаются во внимании, чем неудовлетворенные акцепторы. Общее количество доноров: 689 — из них похоронено: 369 Общее количество акцепторов: 737 — из них захоронено: 309 Общее количество доноров+акцепторов: 110 (например, сир Огамма, который может жертвовать и принимать) — из них захоронено: 21 Захоронено доноров: 369 — без Н-связи: 21 — практически без Н-связи: 0 — только с очень плохой водородной связью: 2 — с плохой водородной связью: 3 — с Н-связью: 343 Захороненных акцепторов: 309 — без Н-связи: 39 — практически без Н-связи: 0 — только с очень плохой водородной связью: 0 — с плохой водородной связью: 3 — с Н-связью: 267 # 103 # Примечание. Содержимое файла PDB в интерпретации WHAT CHECK Содержимое файла PDB, интерпретируемое WHAT CHECK.WHAT CHECK прочитал ваш файл PDB и сохранил его внутри так называемого ‘суп’. Состав этого супа указан здесь. Подробное объяснение всех часто используемых выходных форматов WHAT CHECK можно найти по адресу swift.cmbi.ru.nl. Посмотрите в выходных форматах. Курс по чтению этого Таблица «Молекулы» является частью веб-сайта WHAT CHECK. 1 1 ( 1) 240 ( 240) Белок /zata/tempdir/2gn… 2 241 ( 1) 480 ( 240) B Белок /zata/tempdir/2gn… 3 481 ( 1) 481 ( 1) C MMA

%PDF-1.3 % 1 0 объект > эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /Type /Page >> эндообъект 4 0 объект > /ProcSet [ /PDF /Text ] >> /Type /Page >> эндообъект 5 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 6 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 7 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 8 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 9 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 10 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 5 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 11 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 12 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 13 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 14 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 15 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 16 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 17 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 18 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 19 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 20 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 21 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 22 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 23 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 24 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 25 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 26 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 15 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 27 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 28 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 29 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 30 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 22 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 31 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 25 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 32 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 26 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 33 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 28 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 34 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 29 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 35 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 35 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 36 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 38 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 37 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 42 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 38 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 43 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 39 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 46 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 40 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 49 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 41 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 52 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 42 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 53 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 43 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 54 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 44 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 56 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 45 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 57 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 46 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 58 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 47 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 59 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 48 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 61 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 49 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 62 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 50 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 63 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 51 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 68 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 52 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 69 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 53 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 54 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 34 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 55 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 48 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 56 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 67 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 57 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 58 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 59 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 60 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 61 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 62 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 63 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 64 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 65 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 66 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 12 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 67 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 13 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 68 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 69 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 70 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 71 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 72 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 19 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 73 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 20 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 74 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 21 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 75 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 22 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 76 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 23 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 77 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 24 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 78 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 26 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 79 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 27 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 80 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 28 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 81 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 29 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 82 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 30 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 83 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 31 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 84 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 32 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 85 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 33 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 86 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 34 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 87 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 35 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 88 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 36 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 89 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 37 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 90 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 38 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 91 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 39 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 92 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 93 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 25 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 94 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 95 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 96 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 97 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 98 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 5 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 99 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 100 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 101 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 102 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 103 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 104 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 105 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 12 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 106 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 13 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 107 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 108 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 15 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 109 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 110 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 111 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 112 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 19 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 113 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 21 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 114 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 22 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 115 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 23 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 116 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 26 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 117 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 118 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 119 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 120 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 121 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 122 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 123 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 5 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 124 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 125 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 126 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 127 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 128 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 129 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 130 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 12 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 131 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 13 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 132 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 15 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 133 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 134 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 135 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 136 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 19 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 137 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 20 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 138 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 21 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 139 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 22 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 140 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 23 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 141 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 24 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 142 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 25 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 143 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 26 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 144 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 27 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 145 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 28 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 146 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 29 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 147 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 30 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 148 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 31 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 149 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 32 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 150 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 33 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 151 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 34 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 152 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 35 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 153 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 36 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 154 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 37 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 155 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 38 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 156 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 39 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 157 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 40 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 158 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 159 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 160 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 161 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 162 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 163 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 5 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 164 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 165 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 166 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 167 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 168 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 169 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 170 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 12 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 171 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 13 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 172 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 173 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 15 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 174 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 175 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 176 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 177 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 19 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 178 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 20 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 179 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 180 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 181 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 182 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 183 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 184 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 185 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 186 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 187 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 188 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 189 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 5 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 190 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 191 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 192 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 193 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 194 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 195 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 196 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 12 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 197 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 13 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 198 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 199 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 15 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 200 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 201 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 202 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 203 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] /XObject > >> /StructParents 19 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 204 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 20 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 205 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 21 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 206 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 22 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 207 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 23 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 208 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 24 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 209 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 210 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 0 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 211 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 1 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 212 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 2 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 213 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 3 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 214 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 4 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 215 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 5 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 216 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 6 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 217 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 7 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 218 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 8 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 219 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 9 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 220 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 10 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 221 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 11 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 222 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 12 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 223 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 13 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 224 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 14 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 225 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 15 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 226 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 16 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 227 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 17 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 228 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [/PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 18 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 229 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 19 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 230 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 20 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 231 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /Font > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 21 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 232 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.320007 841.919983 ] /Parent 2 0 R /Resources > /ProcSet [ /PDF /Text /ImageB /ImageC /ImageI ] >> /StructParents 22 /Tabs /S /Type /Page >> эндообъект 233 0 объект > /MediaBox [ 0 0 595.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.