Схема стабилизатора асн 5000 1 ц: Стабилизатор напряжения Ресанта АСН-5000 1-Ц схема

RESANTA ASN-2000 N 1-C — купить по низкой цене в интернет-магазине Joom

Стабилизатор напряжения ASN-2000N / 1-C «Ресанта» предназначен для обеспечения качественного и долговременного электроснабжения. работа различных бытовых устройств в условиях нестабильного напряжения в сети. Этот стабилизатор может обеспечить стабильное питание — телевизор, ресивер, DVD-плеер, кассовый аппарат, газовый котел .. Принцип работы. Регулировка напряжения происходит путем переключения обмоток на трансформаторе с помощью реле.Поэтому такой стабилизатор называют «релейным». осуществляется пошаговая регулировка. при ступенчатой ​​регулировке точность выходного напряжения увеличивается до 8%, т.е. 17,6 В, что вполне приемлемо для всей бытовой техники. Но за счет этого время настройки сокращается, оно минимально и составляет 20-35 мсек, т.е. менее 1 секунды! такой стабилизатор следует устанавливать в местах, где входное напряжение постоянно меняется.

Стабилизатор напряжения ACC-2 000N / 1-TS Resant имеет мощность 2 кВт, этой мощности достаточно для питания отдельных потребителей, или нескольких потребителей, небольших объектов в целом, но общее потребление не должно превышать установленную мощность. рейтинг.Диапазон входного напряжения стабилизатора составляет 140-260 Вольт, но когда входное напряжение опускается ниже 190 Вольт, начинается потеря выходной мощности, при минимальном входном напряжении 140 Вольт выходная мощность уменьшается на 50% и будет 2,0 кВт. Если входное напряжение надолго превышает допустимые значения, система защиты отключит выходное напряжение, а сам стабилизатор перейдет в режим защиты. При перегреве стабилизатора также произойдет аварийное отключение выходного напряжения.Максимальное значение температуры обмотки трансформатора может достигать 70 ° C, нагрев трансформатора напрямую зависит от температуры окружающей среды. Стабилизатор также защищен от короткого замыкания с помощью предохранителя.

Основные характеристики Торговая марка: RESANTA Выходное напряжение, В: 202 … 238 Мощность, Вт: 2 000 ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ,%: 97 Задержка включения, с: 0 … 0,1 Класс защиты: IP20 Защита от высокого напряжения, В: 255 … 265 Защита от короткого замыкания: Да Защита от перегрева: Да Функция байпаса: Нет Охлаждение: воздушное Температурный диапазон, ° С: 0…45 Вес продукта, кг: 5,5 Напряжение сети, В: 140 … 260 Частота тока, Гц: 50 Вес нетто, кг: 4,96 Полная масса, кг: 5,14 Размеры упаковки, см: 29 х 18 х 23 EAN13: 460605^{12 Модель: RESANTA ASN-2000 N / 1-C}

Регуляторы / стабилизаторы напряжения

Тип продукта: Мультиметры

IFITM3 функционирует как каркас PIP3 для усиления передачи сигналов PI3K в B-клетках

Статистические методы не использовались для предварительного определения размера выборки. Эксперименты не были рандомизированы, и исследователи не были закрыты для распределения во время экспериментов и оценки результатов.

Анализ экспрессии генов пациента и данных результатов

Данные микрочипов экспрессии генов трех больших групп пациентов с пре-В ОЛЛ были загружены из GSE5314 ²⁷ (Клиническое исследование E2993 Восточной совместной онкологической группы (ECOG)), GSE11877 ²⁸ (Клиническое испытание P9906 Детской онкологической группы (COG)), Детский исследовательский госпиталь Св. Джуда, ALL ²⁹ (http://www.stjuderesearch.org/site/data/ALL3/). В ECOG E2993 образцы костного мозга или периферической крови перед лечением были получены при постановке диагноза перед началом лечения у 83 пациентов с Ph ⁺ B-ALL, включенных в Совет медицинских исследований (MRC) UKALLXII / Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) E2993, фаза III. испытание.В наборе данных из детства Сент-Джуда 15 случаев Ph ⁺ B-ALL были отобраны из исходных 327 диагностических аспиратов костного мозга. Данные о минимальной остаточной болезни (MRD) были доступны для пациентов с педиатрическим B-ALL высокого риска (COG P9906). Уровни экспрессии IFITM3 были измерены у пациентов с положительным статусом MRD (MRD ⁺ ) или отрицательным статусом MRD (MRD ^–). В клиническом исходе COG P9906 профили экспрессии были получены в образцах лейкемии до лечения от 207 равномерно пролеченных детей с высоким риском ALL ³⁰ , категорией риска, в значительной степени определяемой клиническими характеристиками до лечения.Пациенты прошли тестирование MRD с помощью проточной цитометрии с двумя комбинациями (CD20 / CD10 / CD45 или CD9 / CD19 / CD34 / CD45) и были определены как MRD-положительные или MRD-отрицательные в конце индукционной терапии (29 день) с использованием порогового значения 0,01. %, как описано ранее ³¹ . Затем РНК была очищена из 207 диагностических образцов перед обработкой с более чем 80% бластов (131 костный мозг, 76 периферическая кровь) и подвергнута микроматрицам. Лог-ранговый тест использовался для оценки статистической значимости.

Первичные человеческие образцы и клеточные линии

Образцы пациентов (дополнительная таблица 7) были получены этично от пациентов, которые дали информированное согласие, и соответствовали требованиям внутренних наблюдательных советов Исследовательского института Бекмана города Надежды.Мы соблюдаем все соответствующие этические нормы. Образцы пациентов были взяты из биопсии костного мозга пациентов с ОЛЛ на момент постановки диагноза или рецидива. Все образцы трансплантировали сублетально облученным мышам NOD.Cg- Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ (мыши NSG, Лаборатория Джексона) посредством инъекции в хвостовую вену. После сбора образцов полученные от пациентов первичные ксенотрансплантаты человеческого пре-B ALL культивировали на строме OP9 в Alpha Minimum Essential Medium (MEMα; Life Technologies) с GlutaMAX, содержащим 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ мл ^-1 пенициллин, 100 мкг мл ^-1 стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия.Линии клеток человека (дополнительная таблица 8) культивировали в RPMI-1640 (GIBCO) с GlutaMAX, содержащим 20% FBS, 100 МЕ мл ^-1 пенициллина, 100 мкг мл ^-1 стрептомицина при 37 ° C в увлажненном инкубаторе. с 5% CO ₂ . Все первичные образцы и клеточные линии человека оказались отрицательными на микоплазму с помощью набора для обнаружения (MycoAlert PLUS, LONZA).

Генетические модели мышей

Генетические модели мышей, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 9. Мыши NOD.Cg- Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ (NSG) были приобретены в лаборатории Джексона. Ifitm3 ^tm1Masu (ref. ³² ) мышей подвергали обратному скрещиванию с фоном C57BL / 6J в течение более восьми поколений. B6.C (Cg) — Cd79a ^{tm1 (cre) Reth} / EhobJ (Mb1-Cre) Мыши были приобретены в лаборатории Джексона. Мыши B6.129S2- Ighm ^tm1Cgn / J (мкМТ) были приобретены в лаборатории Джексона. C; 129S4- Pten ^tm1Hwu / J ( Pten ^{fl / fl} ) мышей были приобретены в лаборатории Джексона.Для мышей домашнего разведения однопометники были рандомизированы в экспериментальные группы. Для анализа инициации лейкемии in vivo перед инъекцией случайным образом распределяли самок мышей NSG в возрасте 8-10 недель. Для создания модели предлейкемических предшественников В-клеток, экспрессирующих BCR – ABL1, LSL -Bcr ^{+ / BCR-ABL1} , мышей ³³ скрещивали со штаммом Mb1-cre ( Mb1-cre × LSL -Bcr ^{+ / BCR-ABL1} ) для удаления стоп-кассеты в ранних пре-В-клетках.Для анализа онкогенного примирования in vivo с использованием Mb1-cre × LSL -Bcr ^{+ / BCR-ABL1} B-предшественников B-клеточных предшественников самок мышей NSG в возрасте от 8 до 10 недель были случайным образом распределены перед инъекцией. Температуру 18–23 ° C при влажности 40–60% поддерживали с циклом 14 часов света / 10 часов темноты. Следующие баллы считались конечной точкой: (1) отказ от еды или питья воды в течение 24 часов; (2) невозможность произвести нормальную регулировку позы или вести себя нормально; и (3) когда опухолевая нагрузка достигла 1.5 см × 1,5 см × 1,5 см (образование язв опухоли не ожидалось). Если мышь потеряла 25% своей начальной массы тела (или достигла 16 г массы тела, независимо от исходного веса), или если мы наблюдали потерю веса 15% при двух последовательных измерениях веса, мы немедленно умерщвляли мышь. Все эксперименты на мышах подлежали институциональному одобрению Комитетом по уходу и использованию животных Бекмана научно-исследовательского института города Надежды.

Первичные клетки и лейкозные клетки мыши

Клетки костного мозга мышей в возрасте 6–10 недель собирали промыванием полостей бедренной и большеберцовой костей охлажденным PBS с последующей фильтрацией через сито 40 мкм для получения суспензии одноклеточных .Клетки селезенки или тимуса экстрагировали напрямую, проталкивая ткани через 40-мкм фильтр в охлажденный PBS. Отфильтрованные клетки дополнительно инкубировали с буфером для лизиса (RBC Lysis Buffer, BioLegend) для лизиса эритроцитов. После промывки PBS клетки подвергали дальнейшим экспериментам. Для IL-7-зависимой культуры пре-B-клеток клетки костного мозга собирали и культивировали в модифицированной Iscove среде Дульбекко (IMDM) (GIBCO) с GlutaMAX, содержащим 20% FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 МЕ мл ^-1 пенициллин, 100 мкг мл ^-1 стрептомицина в присутствии 10 нг мл ^-1 рекомбинантного мышиного IL-7 (Peprotech).Для модели лейкемии BCR-ABL1 пре-В-клетки ретровирусно трансформировали BCR-ABL1 , а затем удаляли IL-7 для отбора трансдуцированных клеток. Nras ^G12D ВСЕ клетки были отобраны с помощью пуромицина (GIBCO) и поддерживались IMDM с добавлением IL-7.

Ретровирусная и лентивирусная трансдукция

Ретровирусный супернатант получали котрансфекцией клеток HEK 293FT ретровирусными конструкциями вместе с pHIT60 (gag-pol) и pHIT123 (для мыши) или pHIT456 (для экотропной оболочки человека) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen).Лентивирусный супернатант для CRISPR-опосредованного редактирования генов получали котрансфекцией клеток HEK 293FT лентивирусными конструкциями вместе с pCDNL / BH и EM140. Трансфицированные клетки HEK 293FT культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM) (GIBCO) с GlutaMAX, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 МЕ мл ^-1 пенициллин, 100 мкг мл ¹ стрептомицин, 25 ммоль л ¹ HEPES, 1 ммоль л ^-1 пируват натрия и 0,1 ммоль л ^-1 заменимых аминокислот в течение 16 часов.После индукции бутиратом натрия (10 мМ) в течение 8 ч супернатант вируса собирали и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Содержащие вирус супернатанты загружали центрифугированием (2000 g, , 90 мин при 32 ° C) на покрытые 50 мкг мл ^-1 ретронектин (Takara) 6-луночные планшеты для нетканевых культур. Для ретровирусной трансдукции 3–5 × 10 ⁶ клеток на лунку трансдуцировали центрифугированием при 600 g в течение 30 мин в соответствующей культуральной среде и выдерживали при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение 48 часов.Для лентивирусной трансдукции 3–5 × 10 ⁶ клеток на лунку центрифугировали при 600 g в течение 30 мин в присутствии надосадочной жидкости лентивируса и поддерживали при 37 ° C и 5% CO ₂ . На следующий день надосадочную жидкость лентивируса заменяли свежей средой.

Вестерн-блоттинг

Клетки, промытые PBS, лизировали в буфере CelLytic (Sigma-Aldrich) с добавлением 1% смеси ингибиторов протеазы (Roche Diagnostics), 1% смеси ингибиторов фосфатазы (EMD Millipore) и 1 мМ PMSF на льду.Всего 10 мкг клеточных лизатов разделяли на мини-сборных гелях (Bio-Rad) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad). Мембраны зондировали соответствующими первичными антителами. Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Invitrogen) и хемилюминесцентным субстратом (Invitrogen), и дополнительно детектировали с помощью экспонирования пленки, системы визуализации UVP BioSpectrum 810 (Thermo Fisher Scientific) или с помощью системы визуализации ChemiDoc MP (BioRad).Антитела, использованные в этом исследовании, представлены в дополнительной таблице 10 и использовались при разведении от 1: 750 до 1: 1000 в блокирующем буфере.

Проточная цитометрия

Клетки, промытые PBS, блокировали блокатором Fc в течение 10 минут на льду, а затем окрашивали соответствующими антителами, перечисленными в дополнительной таблице 10, или изотипическим контролем в течение 25 минут на льду. Затем клетки промывали и ресуспендировали в охлажденном PBS, содержащем 0,75 мкг / мл ^-1 DAPI, чтобы исключить мертвые клетки. Сбор данных выполняли с помощью проточного цитометра LSRFortessa (BD Biosciences) с программным обеспечением BD FACSDIVA.Сортировку клеток на основе флуоресценции выполняли с помощью FACSAria II (BD Biosciences) с программным обеспечением BD FACSDIVA. Данные FACS анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo). Для анализа апоптоза использовали аннексин V и 7-AAD (BD Biosciences). Для анализа клеточного цикла использовали набор для проточной цитометрии BrdU (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Для внутриклеточного окрашивания цитоплазматических белков клетки сначала окрашивали на антигены клеточной поверхности, а затем фиксировали в растворе для фиксации и пермеабилизации (BD Biosciences), содержащем 4% параформальдегида и детергентный сапонин.Затем клетки промывали и ресуспендировали в буфере Perm / Wash Buffer (BD Biosciences) и окрашивали соответствующими антителами. Для статистической количественной оценки данные были нанесены на график с помощью GraphPad Prism 7 или SigmaPlot. Антитела FACS, перечисленные в дополнительной таблице 10, были предварительно разведены 1: 5–1: 10. Два мкл разведенного антитела добавляли к 1-2 миллионам клеток на 50 мкл в PBS для конечного разведения 1:50 для клеток человека или 1: 200 для клеток мыши.

Фармакологические ингибиторы и реагенты

Иматиниб был приобретен в LC Laboratories.Исходные растворы готовили в стерильной воде в концентрации 10 ммоль л ^-1 и вводили в концентрации 10 мкмоль л ^-1 . Дазатиниб был приобретен в компании SelleckChem. Исходные растворы готовили в стерильном ДМСО в концентрации 25 мкмоль л ^-1 и вводили в концентрации 25 нмоль л ^-1 (дополнительная таблица 11).

Анализ иммунопреципитации хроматина с данными секвенирования

Иммунопреципитация хроматина IKZF1 с секвенированием (ChIP-seq) выполняли, как описано ранее ³⁴ , с полученной от пациента линией ксенотрансплантатов B-ALL человека (LAX2), которая экспрессирует клетки дикого типа. полноразмерный IKZF1 и отсутствие детектируемого уровня доминантно-отрицательной изоформы IKZF1.Дорожки ChIP-seq (GSE58825) для антитела IKZF1 в LAX2 на промоторных областях гена IFITM3 показаны в нижней части расширенных данных на рис. 1m. Ось y представляет нормализованное количество считываний на миллион считываний для вершины пика для каждого трека. Дорожки ChIP-seq (GSE86897) для обогащения RNAPII и h4K4me3 в локусе Ifitm3 в пре-B-клетках мышей Ikzf1 ^{exon5fl / fl} после Cre-опосредованной делеции Ikzf1 показаны в вверху расширенных данных Рис.1м. Пики ChIP-seq были вызваны вызывающим MACS пиком путем сравнения плотности считывания в эксперименте ChIP относительно считывания входного контроля хроматина и показаны в виде полос под каждой дорожкой покачивания. Генные модели показаны в браузере генома UCSC hg19. Integrative Genomics Viewer (IGV) использовался для визуализации треков ChIP-seq.

Индуцируемая экспрессия IKZF1

Положительные по хромосоме Филадельфии человека ( Ph ⁺ ) пре-B ALL клетки (BV173), несущие делеции IKZF1 , трансдуцировали с помощью pRetroX-Tet3G-Neo.Клетки, устойчивые к неомицину, трансдуцировали pRetroX-TRE3G-IKZF1-Puro дикого типа. Экспрессию IKZF1 дикого типа в устойчивых к пуромицину клетках инициировали обработкой 1 мкг мл ^-1 доксициклина (TetOn).

Индуцируемое восстановление CD19

Для индуцибельного восстановления CD19 мышиный CD19 сливали с лиганд-связывающим доменом мутантного рецептора эстрогена (ER ^T2 ) на С-конце CD19. BCR – ABL1-трансформированные мышиные клетки B-линии ALL ретровирусно трансдуцировали MSCV CD19-ER ^T2 -Puro.Клетки, устойчивые к пуромицину, обрабатывали 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT) (Sigma-Aldrich) или контрольным носителем, чтобы вызвать восстановление CD19.

Анализ жизнеспособности клеток

Сто тысяч BCR – ABL1-трансформированных мышей B-линии ALL клеток высевали в объеме 100 мкл в среду в 1 лунку 96-луночного планшета (BD Biosciences). Иматиниб (LC Laboratories) добавляли в указанной концентрации в общем объеме 150 мкл. После культивирования в течение 3 дней в каждую лунку добавляли 15 мкл резазурина (R&D) и инкубировали в течение 4 ч при 37 ° C.В качестве бланка использовали среду без клеток. Флуоресценция считывалась при 535 нм, а эталонная длина волны составляла 590 нм. Относительную жизнеспособность рассчитывали с использованием исходных значений клеток, обработанных носителем, в качестве эталона.

Анализ образования колоний

Анализы образования колоний метилцеллюлозы проводили с 10 000 клеток. Клетки ресуспендировали в мышиной среде MethoCult (без цитокинов для клеток, трансформированных BCR-ABL1 ; с IL-7 для клеток, экспрессирующих NRAS ^G12D ) и культивировали на чашках диаметром 3 см с дополнительным емкость для подачи воды, чтобы предотвратить испарение.Колонии были визуализированы и подсчитаны через семь дней с использованием GelCount (Oxford Optronix), микроскопа Olympus IX71 и Q-Capture pro 7.

In vitro IFITM3 – HA crosslinking

Восемь миллионов полученных от пациентов B-ALL клеток на образец ресуспендировали до полной среду и обрабатывали либо 2,5 мкг мл ^-1 поликлональных анти-HA (Abcam), либо изотипическим контролем в течение указанного времени. Фрагменты F (ab) для антитела против НА были получены с использованием набора для приготовления F (ab) в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific).Фрагментацию F (ab) подтверждали с помощью сборных гелей без пятен Criterion TGX (Bio-Rad).

Измерение мобилизации внутриклеточного кальция

В расширенных данных Рис. 2f, 1 миллион свежих спленоцитов инкубировали с 4 мкМ Rhod-2-AM Ca ²⁺ -связывающим красителем (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 минут при комнатной температуре. в темноте. Затем клетки ресуспендировали в PBS и поддерживали при 37 ° C, и ответ на Ca ²⁺ индуцировали добавлением 10 мкг / мл ^-1 поликлонального анти-IgM (Southern Biotech) через 50 с после получения фоновой флуоресценции.Внутриклеточную мобилизацию Ca ²⁺ в ответ на сшитый IgM измеряли до 300 с с помощью проточной цитометрии. На рис. 4с с расширенными данными 1 × 10 ⁶ жизнеспособных клеток Jurkat инкубировали с 4 мкМ Fluo4-AM Ca ²⁺ -связывающим красителем (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Затем клетки ресуспендировали в PBS и поддерживали при 37 ° C, и ответ на Ca ²⁺ индуцировали добавлением 10 мкг / мл ^-1 моноклональных (OKT3) очищенных NA / LE античеловеческих CD3 (Biolegend) через 50 с. после получения фоновой флуоресценции.Внутриклеточную мобилизацию Ca ²⁺ в ответ на сшитый IFITM3 измеряли до 300 с с помощью проточной цитометрии. Та же процедура была выполнена для расширенных данных (рис. 6f); 1 × 10 ⁶ жизнеспособных клеток Jeko1 инкубировали с 4 мкМ Fluo4-AM (Thermo Fisher Scientific). Ответ на Ca ²⁺ индуцировали добавлением 10 мкг / мл ^-1 поликлональной μ-цепи F (ab ‘) ₂ человека (Jackson Immunoresearch).

Анализ гомотипической агрегации

Ifitm3 ^{— / —} Клетки B-ALL, экспрессирующие C-концевой HA-меченный IFITM3 дикого типа, мутантный вектор IFITM3 (Y20E) или пустой вектор, инкубировали с 2.5 мкг мл ⁻¹ моноклональных (1D3) очищенных LEAF антимышиных CD19 (Biolegend) или 2,5 мкг мл ⁻¹ поликлональных анти-HA (Abcam) или изотипических контролей при 37 ° C и 5% CO ₂ . После культивирования в течение 24 ч гомотипическую агрегацию визуализировали с помощью световой микроскопии.

Анализ онкогенного праймирования in vivo с использованием

Для создания модели предлейкемических предшественников В-клеток, экспрессирующих BCR – ABL1, мышей с нокаутом BCR – ABL1 скрещивали со штаммом Mb1 – Cre ( Mb1-cre × LSL -Bcr ^{+ / BCR-ABL1} ) для удаления стоп-кассеты в ранних пре-В-клетках.Клетки костного мозга, собранные у мышей Mb1-cre × LSL -Bcr ^{+ / BCR-ABL1} , культивировали в присутствии 10 нг мл рекомбинантного мышиного IL-7 ^-1 (Peprotech). IL-7-зависимые предлейкемические В-клетки метили ретровирусной люциферазой светлячков и отбирали бластицидином в течение 7 дней. После отбора клетки дополнительно трансдуцировали MSCV-IFITM3-HA-IRES-Puro, MSCV-IFITM3 ^Y20E -HA-IRES-Puro или пустым вектором и отбирали пуромицином в течение 3 дней.Жизнеспособные клетки (1 × 10 ⁷ ) инъецировали через хвостовую вену сублетально облученным (200 сГр) мышам-реципиентам NSG. Распространение in vivo и бремя лейкемии контролировали с помощью люциферазной биовизуализации (система биолюминесценции и оптической визуализации IVIS 100; Xenogen) в указанные моменты времени. Вкратце, d-люциферин (Promega), растворенный в PBS, вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5 мг на мышь за 15 мин до измерения люминесценции. Всех мышей анестезировали 5% изофлураном и продолжали во время обнаружения излучения света 2% изофлураном, введенным через носовой конус.Мышей умерщвляли, когда у них проявлялись признаки лейкемии, такие как сгорбленная спина, потеря веса и неспособность двигаться. Анализ выживаемости Каплана-Мейера был выполнен с использованием GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) для сравнения общей выживаемости. Лог-ранговый критерий Мантела-Кокса использовался в качестве статистического анализа с использованием GraphPad Prism 7 (дополнительная таблица 4).

Анализ клеточной адгезии

Ifitm3 ^{+ / +} или Ifitm3 ^{— / —} BCR-ABL1 B-ALL клетки трансдуцировали с помощью MSCV-IK6-IRES-GFP или MSCV-IRES-GFP как отрицательный контроль.Клетки GFP ⁺ (1 × 10 ⁵ ), отсортированные с помощью FACS, культивировали на строме 1,5 × 10 ⁵ OP9 на 6-луночном планшете с IMDM-GlutaMAX, содержащим 20% FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 МЕ. пенициллин ^-1 мл и стрептомицин 100 мкг мл ^-1 . Для расчета соотношения прикрепленных и неприлипающих клеток неприлипающие клетки собирали и подсчитывали методом исключения трипанового синего с использованием автоматического счетчика клеток Countess II FL (Life Technologies). После двукратной промывки планшета PBS адгезивные клетки отделяли с помощью трипсинизации, а клетки GFP ⁺ B-ALL и подсчитывали методом исключения трипанового синего с использованием автоматического счетчика клеток Countess II FL (Life Technologies) и рассчитывали соотношения.

Адоптивный перенос очищенных В-клеток мышам μMT

Для адоптивного переноса В-клеток спленоциты от 7- до 10-недельного возраста Ifitm3 ^{+ / +} или Ifitm3 ^{— / —} мышей были отрицательно отобран с помощью набора для выделения клеток Pan B MojoSort II (Miltenyi Biotec) с использованием иммуномагнитных шариков против CD3, CD4, CD8a, CD11c, CD49b, Ly6G / Ly6C (GR1) и TER119. Десять миллионов отсортированных по потоку В-клеток селезенки внутривенно вводили мышам μMT (B6.129S2- Ighm ^tm1Cgn / J), которые лишены экзона Cμ и развития зрелых В-клеток в результате дефектной экспрессии поверхностного IgM. Восстановление донорских В-клеток определяли с помощью проточной цитометрии через 20 дней после инъекции. Мышей-реципиентов μMT иммунизировали гаптеном NP, связанным с белком-носителем (KLH) в день 0 и день 7, а селезенки собирали на день 12, а селезенки собирали на 12 день.

Иммунизация и иммуногистология

Ifitm3 ^{+ / +} и Ifitm3 ^{— / —} мышей из однопометного помета иммунизировали 0.5 мг NP – KLH (Biosearch Technologies) в квасцах (Sigma-Aldrich) внутрибрюшинно. Через семь дней мышей иммунизировали второй раз в течение пяти дней. Селезенки выделяли на 12 день после иммунизации. Селезенку заливали компаундом с оптимальной температурой резки, и для окрашивания использовали криосрезы толщиной 5 мкм. Срезы фиксировали ацетоном в течение 10 мин, а неспецифические антигены блокировали в DPBS, содержащем 2% FBS, в течение 15 мин. Срезы окрашивали разбавленными 1: 200 поликлональными (RA3-6B2) анти-CD45R (B220, BD Biosciences), моноклональными антителами против CD3 мыши (17A2, BioLegend) и биотинилированным агглютинином арахиса (B-1075, Vector Laboratories) в течение 45 мин. .Срезы промывали и дополнительно окрашивали антителом к ​​стрептавидину Alexa Fluor 647 (BioLegend) в течение 45 мин. Все антитела разводили 1: 100 до их исходной концентрации в блокирующем буфере. После промывки блокирующим буфером срезы помещали в ProLong Diamond Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific). Изображения были получены на конфокальном микроскопе ZEISS LSL 880 и проанализированы с помощью программного обеспечения ZEN 2.3 (Zeiss).

Измерения ELISA

Для определения концентраций изотипов иммуноглобулинов в сыворотке ELISA выполняли в соответствии с протоколом производителя (набор для мгновенного ELISA для определения иммуноглобулина мыши для IgG1, IgG2b и IgM) (дополнительная таблица 11).NP-специфические антитела измеряли с помощью ELISA с использованием 10 мкг / мл NP (24) –BSA (Biosearch Technologies) в качестве реагента для покрытия. NP-специфические IgM и IgG1 были обнаружены с использованием козьих антимышиных IgM и IgG1 Fc-специфических антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и проявленных с тетраметилбензидином (Sigma). Оптическую плотность определяли с использованием ридера для ELISA при 450 нм (SpectraMax M3, Molecular Devices).

Анализ РНК-секвенирования

Общая мРНК из Ifitm3 ^{+ / +} и Ifitm3 ^{— / —} BCR-ABL1 или NRAS ^G12D B-ALL клеток была извлечена с помощью RNeasy Комплект (Qiagen) согласно инструкции производителя.Секвенирование выполняли на приборе Illumina Hiseq 2500 (Illumina) с использованием набора TruSeq SR Cluster Kit v.4-cBot-HS (Illumina) с химией v.4. Контроль качества считываний РНК-секвенирования выполняли с помощью FastQC. Для анализа считанные необработанные последовательности были сопоставлены с геномом мыши (mm10) с помощью STAR v.2.5.3 ³⁵ , а частота генов была подсчитана с помощью featureCounts v.1.5.1 ³⁶ . Необработанные подсчеты затем нормализовали с использованием метода усеченного среднего значения M и сравнивали с использованием пакета Bioconductor ‘edgeR’ ³⁷ .Чтения на килобазу на миллион (RPKM) сопоставленных чтений также рассчитывались из необработанных подсчетов. Для анализа дифференциальной экспрессии транскрипты были количественно определены с использованием Salmon v.1.1.0 против аннотаций транскриптов генкода GRCm38 v.M24; нормализация и статистический анализ были выполнены в R с использованием DESeq2 v.1.28.1. Дифференциально экспрессируемые гены были идентифицированы, если RPKM ≥ 1 по крайней мере в одном образце, кратное изменение ≥ 2 и P ≤ 0,05 (расширенные данные, рис. 3b). Данные RPKM позже были использованы в анализе обогащения набора генов (GSEA).GSEA был выполнен с использованием пакета DOSE в R ³⁸ ; гены ранжировали по логарифму: ₂ -трансформированных кратных изменений; и наборы генов были получены из MSigDB или из внутренних данных, как указано.

CRISPR-опосредованная делеция гена

Все лентивирусные конструкции, экспрессирующие нуклеазу Cas9 и направляющую РНК, были приобретены у Transomic Technologies. Для делеции гена клетки трансдуцировали pTOL-hCMV-Tet3G-Hygromycin. Затем устойчивые к гигромицину клетки трансдуцировали pCLIP-Tre3g-hCMV-Cas9-P2A-zsGreen.Экспрессию Cas9 – P2A – zsGreen индуцировали 1 мкг / мл ^-1 доксициклина в течение 16 ч, и клетки zsGreen ⁺ сортировали методом проточной цитометрии. Клетки промывали для удаления доксициклина, чтобы выключить экспрессию Cas9 (TetOff), а затем затем трансдуцировали pCLIP-gRNA-hCMV-RFP-gRNA. Отсортированные клетки RFP ⁺ подвергали дальнейшим экспериментам. Делецию гена инициировали обработкой 1 мкг / мл ^-1 доксициклина (TetOn). Ненаправляющая направляющая РНК использовалась в качестве контроля.

Делеция гена путем нацеливания на невирусный геном

Химически синтезированные РНК CRISPR (160 мкМ) и трансактивирующие РНК CRISPR (160 мкМ) смешивали 1: 1 по объему и отжигали инкубацией при 37 ° C в течение 30 мин. . Рекомбинантно продуцируемый Cas9 (40 мкМ) затем смешивали 1: 1 по объему с пРНК для получения комплексов РНК-рибонуклеопротеина (РНП). Перед электропорацией RNP образовывали свежие комплексы. Электропорацию проводили с использованием импульсного кода EH-115 на 96-луночной системе электропорации Lonza 4D.Предварительно сконструированные направляющие РНК Alt-R CRISPR-Cas9 были приобретены у IDT. Нецелевые контрольные направляющие РНК были приобретены у IDT.

Коиммунопреципитация

Коиммунопреципитацию проводили с помощью набора Pierce Crosslink Magnetic IP / Co-IP в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific). Вкратце, полученные от пациента клетки Ph ⁺ ALL (PDX2) трансдуцировали с помощью MSCV Flag-IRES-Puro или MSCV Flag-IFITM3-IRES-Puro и отбирали в пуромицине в течение 3 дней.Жизнеспособные клетки (5 × 10 ⁷ ) собирали и промывали PBS перед лизисом с использованием буфера для лизиса / промывки IP (Thermo Fisher Scientific). Затем 5 мкг антитела M2 против Flag (F1804, Sigma-Aldrich) на образец связывали с магнитными шариками белка A / G и ковалентно сшивали с 20 мкМ дисукцинимидил-субератом. Сшитые антителами гранулы инкубировали с клеточным лизатом, промывали для удаления несвязавшегося материала и элюировали элюирующим буфером с низким pH, который диссоциирует связанный антиген от сшитых антителами гранул.Обогащенный антиген при низком pH немедленно нейтрализовали и подвергали вестерн-блоттингу. Клетки Jeko1, подвергнутые электропорации с помощью не нацеливающего RNP или IFITM3 -нацеливающего RNP-комплекса, стимулировали 10 мкг мл ^-1 F (ab ‘) ₂ фрагмента козьей античеловеческой μ-цепи (Jackson Immunoresearch) в течение указанного времени. точки при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клетки немедленно промывали охлажденным PBS и подвергали совместной иммунопреципитации с антителом к ​​CD19 (№

, CST).

PLA

Для PLA пре-BCR или BCR-IFITM3 клетки инкубировали с 10 мкг мл ^-1 F (ab ‘) ₂ фрагмент козьей античеловеческой μ-цепи (Jackson Immunoresearch) в течение 5 мин при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клетки немедленно промывали охлажденным PBS и затем фиксировали в буфере для фиксации (Biolegend), содержащем 4% параформальдегид, в течение 25 минут на льду, а затем промывали охлажденным PBS. Для окрашивания клеточной мембраны клетки метили 5 мкг мл ^-1 WGA, конъюгированного с Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific), в течение 5 минут при комнатной температуре.Затем клетки подвергали проницаемости в буфере Perm / Wash (BD Biosciences) и затем блокировали в буфере Duolink Blocking в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали с первичными антителами, разведенными 1: 150, перечисленными в дополнительной таблице 10, в течение ночи при 4 ° C. Для позднего окрашивания эндосом клетки инкубировали с анти-человеческим LAMP1, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (R&D Systems) с первичными антителами. Клетки промывали и осаждали на покрытом Cell-Tak (Corning) одинарном цитозоле Shandon с цитоспином при 400 г в течение 5 мин.Реакции с PLA проводили согласно протоколу производителя (Duolink, Sigma). Вкратце, первичные антитела были связаны с зондами Duolink in situ PLA PLUS или MINUS (Sigma-Aldrich), а затем зонды были визуализированы с помощью Duolink Detection Reagent Red (Sigma-Aldrich). Клетки помещали в среду Duolink для монтажа in situ с DAPI (Sigma-Aldrich). Микроскопические изображения получали с использованием Olympus IX3-55 и анализировали с помощью программного обеспечения для визуализации CellSens (Olympus) и ImageJ. Для количественной оценки сигналов PLA одна точка была определена программным обеспечением BlobFinder как пиксель размером 5 × 5.Статистическая значимость была рассчитана с использованием непарного теста Стьюдента t в Excel и нанесена на график с помощью GraphPad Prism 7.

Фосфопротеомный анализ

Клетки B-ALL (PDX2), полученные от пациента, трансдуцированные HA-меченным IFITM3 (Y20E) или пустым векторным контролем. инкубировали с 2,5 мкг мл ^-1 поликлонального анти-HA (Abcam) в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клеточные экстракты готовили в буфере для лизиса мочевины, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали, восстанавливали DTT и алкилировали йодацетамидом.Пятнадцать мг общего белка для каждого образца обрабатывали трипсином, и 500 мкг общего белка для каждого образца обрабатывали смесью LysC и трипсина для анализа IMAC. Образцы очищали на колонках C18 и сушили в лиофилизаторе. Высушенные образцы ресуспендировали и обогащали гранулами Fe-IMAC, очищали с помощью наконечников C18 STAGE (Rappsilber). Повторные инъекции каждого образца выполнялись на приборе непоследовательно. Пептиды элюировали с использованием 150-минутного (IMAC) линейного градиента ацетонитрила в 0.125% муравьиная кислота доставляется со скоростью 280 нл / мин. Тандемные масс-спектры (МС / МС) собирали в зависимости от данных с помощью масс-спектрометра Thermo Orbitrap Fusion Lumos Tribrid с использованием метода МС / МС первой двадцатки, динамического подсчета повторов, равного единице, и продолжительности повтора, равной 30 с. Повторная калибровка погрешности массы в реальном времени была выполнена с использованием замковой массы (Olsen) с однозарядным полисилоксановым ионом m / z = 371,101237. Спектры МС / МС оценивали с использованием SEQUEST и платформы Core Гарвардского университета (Дж.К. Энг, Э. Л. Хаттлин и Дж. Виллен). Поиск файлов проводился в базе данных SwissProt Homo sapiens FASTA. Погрешность измерения массы ± 5 ppm была использована для ионов-предшественников и 0,02 Да для ионов-продуктов. Ферментная специфичность была ограничена трипсином, по крайней мере, с одним триптическим (K- или R-содержащим) концом на пептид и допускалось до четырех неправильных расщеплений. Карбоксамидометилирование цистеина было определено как статическая модификация, а окисление метионина и фосфорилирование остатков серина, треонина и тирозина допускались как вариабельные модификации.Базы данных обратной ловушки были включены для всех поисков, чтобы оценить частоту ложного обнаружения, и отфильтрованы с использованием коэффициента ложного обнаружения 1% в линейном дискриминантном модуле Core. Пептиды также фильтровали вручную с использованием диапазона ошибок массы ± 5 м.д. и присутствия фосфорилированного остатка. Все количественные результаты были получены с использованием Skyline (MacLean) для извлечения интегрированной площади пика соответствующих назначений пептидов. Точность количественных данных обеспечивалась ручным просмотром в Skyline или в файлах ионных хроматограмм.

Протеомика Bio-ID

Клетки B-ALL PDX2, полученные от пациента, и клетки MCL Jeko1 трансдуцировали с помощью помеченных флагом IFITM3 (Y20E) или IFITM3 (K83A / K104A) мутантных конструкций с N-концевым Turbo-ID BirA (сконструированный биотин). лигаза) и селекция пуромицином в течение трех дней. Конструкцию, экспрессирующую Turbo-ID BirA, помеченную Flag, использовали в качестве отрицательного контроля. Чтобы вызвать биотинилирование белков, проксимальных к IFITM3, клетки обрабатывали 50 мкмоль биотина ^-1 и антителом против НА для одновременной индукции перекрестного связывания IFITM3 в течение 10 мин.Клетки трижды промывали охлажденным PBS и лизировали в буфере IP / WASH (Thermo Fisher Scientific) с 1 × ингибитором протеазы HALT (Thermo Fisher Scientific). Лизаты инкубировали со стрептавидином C1 MyOne Dynabeads (Invitrogen) в течение 16 ч при 4 ° C. Несвязанные белки промывали 3 раза 2% SDS – PBS, 3 раза PBS и 3 раза чистой водой. Элюированные белки очищали в геле с последующим расщеплением в геле и подвергали масс-спектрометрии. Для анализа методом жидкостной хроматографии (ЖХ) и МС / МС пептиды анализировали с использованием системы ЖХ для быстрого разделения Dionex UltiMate 3000 и масс-спектрометра Orbitrap (ThermoFisher Scientific).Образцы пептида по 6 мкл загружали в колонку-ловушку, размер которой составлял 150 мкм × 3 см и которая была заполнена 3 мкм гранулами C18. Аналитическая колонка представляла собой колонку PicoChip 75 мкм × 10,5 см, заполненную гранулами C18 размером 3 мкм (New Objectives). Скорость потока поддерживалась на уровне 300 нл / мин. Растворитель A представлял собой 0,1% муравьиной кислоты (FA) в воде, а растворитель B представлял собой 0,1% FA в ACN. Пептид разделяли с помощью 120-минутного аналитического градиента от 5% ACN и 0,1% FA до 40% ACN и 0,1% FA. Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных.Напряжение источника составляло 2,40 кВ, а температура капилляра составляла 275 ° C. Сканы MS1 были получены от 400–2000 м / z при разрешающей способности 60 000 и автоматической регулировке усиления (AGC), установленной на 1 × 10 ⁶ . Для фрагментации были выбраны 15 наиболее распространенных ионов-предшественников в каждом сканировании MS1. Прекурсоры были отобраны с изоляцией шириной 1 Да и фрагментированы индуцированной столкновением диссоциацией при 35% нормированной энергии столкновения в ионной ловушке; ранее отобранные ионы динамически исключались из повторного выбора на 60 с.Для MS2 AGC было установлено значение 3 × 10 ⁵ . Для анализа данных белки были идентифицированы из исходных файлов масс-спектрометрии с использованием поисковой системы Mascot (Matrix science). Спектры МС / МС анализировали по базе данных SwissProt по людям. Все поиски включали карбамидометилцистеин как фиксированную модификацию и окисленный Met, деамидированный Asn и Gln и ацетилированный N-конец как вариабельные модификации. Допускались три пропущенных триптических расщепления. Допуск по массе предшественника MS1 был установлен на 10 ppm, а допуск MS2 был установлен на 0.6 Да. На уровне пептида было применено ограничение частоты ложных открытий в 1%. Для дальнейшего изучения рассматривались только белки с минимум двумя пептидами выше порогового значения. Для сравнения с пустым векторным контролем содержания фоновых пептидов для отсутствующих значений были рассчитаны из распределения Гаусса с центром вокруг минимального наблюдаемого содержания с использованием метода MinProb из пакета MSnbase в R.

Анализы протеома клеточной поверхности

Белки клеточной поверхности были помечены с биотином с использованием метода мечения биотином сайта N-связанного гликозилирования ³⁹ .Вкратце, 40 миллионов Ifitm3 ^{+ / +} или Ifitm3 ^{— / —} B-ALL клеток дважды промывали и ресуспендировали в 1 мл ледяного PBS и обрабатывали 1,6 мМ метапериодата натрия (VWR). при 4 ° C в течение 20 мин для окисления вицинальных диолов остатков сахаров, связанных с поверхностными белками. Затем клетки дважды промывали PBS для удаления избытка метапериодата натрия. Клетки ресуспендировали в 1 мл ледяного PBS и обрабатывали 1 мМ гидразида биоцитина (Biotium) и 10 мМ анилина (Sigma-Aldrich) при 4 ° C в течение 90 минут с осторожным перемешиванием для получения свободных от биотинилирования альдегидов на остатках сахара.После мечения клетки промывали 3 раза ледяным PBS для удаления избытка биотина, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки для масс-спектрометрии. Все эксперименты проводили в трех биологических повторах с повторениями, собранными из последовательных пассажей. Осадки замороженных клеток размораживали на льду в 1 мл буфера RIPA (Millipore) с добавлением 1 × ингибиторов протеазы HALT (Pierce). После инкубации на льду в течение 10 минут клетки разрушали обработкой ультразвуком, а лизаты осветляли центрифугированием при 17000 rcf при 4 ° C в течение 10 минут.Осветленный лизат смешивали с 500 мкл нейтравидиновой агарозной смолы (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали при 4 ° C в течение 2 ч с перемешиванием конец за концом. Гранулы нейтравидина с захваченными биотинилированными поверхностными белками были тщательно промыты гравитационным потоком для удаления несвязанных белков с использованием 50 мл 1 × RIPA + 1 мМ EDTA, затем 50 мл PBS + 1 M NaCl и, наконец, 50 мл 50 мМ ABC + 2 M буфер мочевины. Промытые шарики ресуспендировали в буфере для переваривания (50 мМ Трис pH 8,5, 10 мМ TCEP, 20 мМ 2-йодацетамид и 1.6 M мочевина) с 10 мкг добавленной трипсиновой протеазы (Pierce, ^{) для одновременного восстановления дисульфидов, алкилирования и расщепления пептидов на гранулах при комнатной температуре в течение ночи (16–20 ч). После переваривания pH понижали примерно до 2 с помощью чистой трифторуксусной кислоты (Sigma-Aldrich), и смесь пептидов обессоливали с использованием колонки SOLA-HRP (Thermo Fisher Scientific) на вакуумном коллекторе. Обессоленные пептиды элюировали 50% ацетонитрилом (Sigma-Aldrich) и 50% воды с 0,1% TFA и полностью сушили в быстродействующем вакууме.Высушенные пептиды ресуспендировали в воде для ЖХ-МС (Fisher) с 2% ACN и 0,1% FA. Концентрацию пептида измеряли с использованием поглощения при 280 нм на Nanodrop, и концентрацию пептида доводили до 0,2 мкг мкл -1 для масс-спектрометрии.}

ЖХ-МС и анализ данных для протеома клеточной поверхности

Для каждой реплики 1 мкг пептида вводили в прибор Dionex Ultimate 3000 NanoRSLC с 15-см обращенно-фазовым Acclaim PEPMAP C18 (Thermo Fisher Scientific, 164534) столбец.Образцы разделяли на 3,5-часовом нелинейном градиенте с использованием смеси буфера A (0,1% FA) и B (80% ACN / 0,1% FA) от 2,4% ACN до 32% ACN. Элюированные пептиды анализировали с помощью масс-спектрометра Thermo Q-Exactive Plus. Обзорное сканирование масс-спектрометрии было выполнено в диапазоне масс 350–1500 м / z с разрешением 70 000 с максимальным временем инжекции 100 мс. Мы выполнили зависящий от данных сбор данных MS2 с разрешением 17 500, AGC 5 × 10 ⁴ и временем впрыска 150 мс.15 наиболее интенсивных ионов-предшественников были фрагментированы в результате столкновительной диссоциации с более высокой энергией при нормированной энергии столкновения 27. Динамическое исключение было установлено на 20 с, чтобы избежать избыточной выборки высокоразвитых частиц. Файлы необработанных спектральных данных доступны в репозитории ProteomeXchange PRIDE (номер доступа PXD014691). Необработанные спектральные данные были проанализированы с помощью MaxQuant v.1.5.1.2 ⁴⁰ для идентификации и количественной оценки содержания пептидов и осуществлен поиск по аннотированному протеому человека Swiss-Prot от Uniprot (загружено с 20 303 записями).Вариант «сопоставление между сериями» был выбран для увеличения идентификации пептидов, а вариант «быстрый LFQ» был выбран для расчета значений количественного определения идентифицированных белков без метки. Для всех остальных настроек оставлены значения MaxQuant по умолчанию. Выходные данные MaxQuant анализировали с помощью Perseus ⁴¹ и программы R (версия 3.4.0). Белки, помеченные как «обратные», «идентифицированные только по участку» и «потенциальное загрязнение», были отфильтрованы, как и белки, которые были количественно определены менее чем в двух из трех биологических повторов по крайней мере в одной экспериментальной группе.Недостающие значения были рассчитаны на основе нормального распределения набора данных, реализованного Perseus. Графики вулканов были созданы с использованием результатов двухвыборочного теста t , сравнивающего логарифм ₂ -преобразованных количественных значений количественного содержания белка без метки из различных клеточных линий с коэффициентом ложного обнаружения, установленным на 0,01. Проверка была проведена с помощью проточной цитометрии (дополнительная таблица 1).

Измерение холестерина и липидного слоя

Для истощения холестерина клетки предварительно инкубировали с 5 мМ метил-β-циклодекстрина в течение 30 минут при 37 ° C перед окрашиванием на филиппин.Для окрашивания ганглиозида GM1 клетки метили холерным токсином B с использованием набора для маркировки липидных рафтов Vybrant (Molecular Probes) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки метили единицей холерного токсина В, конъюгированной с Alexa Fluor 594 на льду в течение 15 мин, дважды промывали PBS. Липидные рафты, меченные холер-токсином-B, перекрестно сшивали антителом против холерного токсина-B на льду в течение 15 мин, дважды промывали PBS и анализировали проточной цитометрией.

Трансплантация лейкозных клеток in vivo

Мышиные клетки pre-B ALL, трансформированные BCR-ABL1 или NRAS (G12D), инъецировали сублетально облученным (200 сГр) мышам NOD- scid IL2Rg ^null (NSG) мышам через хвостовая вена.Перед инъекцией случайным образом распределяли самок мышей NSG в возрасте восьми-десяти недель. Мышей умерщвляли, когда у них проявлялись признаки лейкемии, такие как сгорбленная спина, потеря веса и неспособность двигаться, а затем собирали костный мозг и / или селезенку для проверки инфильтрации лейкемии с помощью проточной цитометрии. Анализ выживаемости Каплана-Мейера был выполнен с использованием GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) для сравнения общей выживаемости. Лог-ранговый критерий Мантела-Кокса использовался в качестве статистического анализа с помощью GraphPad Prism 7 (дополнительная таблица 3).Минимальное количество мышей в каждой группе рассчитывали с использованием функции «cpower» в пакете Hmisc R. Ослепление не применялось. Все эксперименты на мышах подлежали институциональному одобрению Комитетом по уходу и использованию животных Бекмана научно-исследовательского института города Надежды.

Количественное определение PIP3

Для рис. 4 60 миллионов жизнеспособных клеток ресуспендировали в охлажденной 0,5 М трихлоруксусной кислоте (TCA) в общем объеме 1 мл и инкубировали на льду в течение 5 мин. Клетки центрифугировали при 3000 об / мин в течение 7 минут при 4 ° C и ресуспендировали в 5% TCA и 1 мМ EDTA в общем объеме 1 мл.После встряхивания в течение 30 с клетки снова промывали 5% TCA и 1 мМ EDTA. Для извлечения нейтральных липидов клетки ресуспендировали в 1 мл MeOH: CHCl ₃ (2: 1), встряхивали в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об / мин в течение 5 мин. После еще одной экстракции нейтральных липидов кислотные липиды экстрагировали, добавляя 750 мкл MeOH: CHCl ₃ : 12 M HCl (80: 40: 1) при интенсивном встряхивании в течение 25 минут при комнатной температуре. После центрифугирования при 3000 об / мин в течение 5 минут супернатант переносили в центрифужную пробирку объемом 2 мл и смешивали с 250 мкл CHCl ₃ и 450 мкл 0.1 M HCl, встряхивают в течение 30 с и центрифугируют при 3000 об / мин в течение 5 мин для разделения органической и водной фаз. Пятьсот мкл нижних органических фаз собирали в чистый 1,5-миллилитровый флакон и сушили в вакуумной сушилке в течение 1 часа. Высушенный липид хранили при -20 ° C. В день анализа образцы липидов восстанавливали 200 мкл PBS, содержащего 0,25% стабилизатора белка; 20 мкл использовали для измерения PI (4,5) P ₂ , а остальные (180 мкл) использовали для измерения PI (3,4,5) P ₃ с использованием набора ELISA (Echelon Biosciences) в соответствии с инструкции производителя.

Экзогенная доставка PIP3

Фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат diC16 (Echelon Biosciences) был свежеприготовлен с помощью PBS в концентрации 2 мМ. Немеченый носитель 2 челночного PIP (гистон h2) был свежеприготовлен с использованием воды в концентрации 2 мМ. PIP ₃ в объеме 75 мкл смешивали с 25 мкл носителя PIP и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Сто мкл комплекса PIP ₃ – носитель добавляли в клетки Ifitm3 ^{+ / +} или Ifitm3 ^{— / —} B-ALL в общем объеме 5 мл и инкубировали в течение 24 часов.PIP _{3, загруженные} Ifitm3 ^{+ / +} или Ifitm3 ^{— / —} B-ALL клетки подвергали колониеобразующему анализу, как показано на рис. 8 расширенных данных.

Для оценки прямого связывания IFITM3 с липидами был проведен анализ связывания липидов с использованием мембранных липидных полосок (Echelon Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, мембраны были заблокированы 5% -ным БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich) в TBST (50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl и 0.1% Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте с последующей инкубацией в течение ночи с 0,5 мкг / мл рекомбинантных белков в блокирующем буфере при 4 ° C при осторожном встряхивании. После промывки мембран 3 раза в течение 30 минут в TBST, мембраны инкубировали в течение 1 часа с поликлональными антителами против GST-метки (Thermo Fisher Scientific) или антителами к моноклональным антителам против биотина (Cell Signaling Technology), перечисленными в дополнительной таблице 10. Мембраны были инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Invitrogen) и хемилюминесцентным субстратом (Invitrogen), и затем детектировали с помощью системы визуализации UVP BioSpectrum 810 (Thermo Fisher Scientific).Рекомбинантный белок с GST-меткой был приобретен у Sigma-Aldrich. Рекомбинантный белок GST-IFITM3 человека был приобретен у Abnova. Рекомбинантные фрагменты IFITM3 человека, перечисленные в дополнительной таблице 5, были синтезированы в LifeTein.

Предпочтительное накопление PIP3 и связывание с IFITM3 с использованием многомасштабного молекулярно-динамического моделирования

Структура белка IFITM3 от остатков 58 до 128 была смоделирована методом крупнозернистой молекулярной динамики в GROMACS в явном двойном слое, имитирующем клеточную мембрану.Нет структуры, доступной для IFITM3 или для любого близкого гомолога. Мы рассчитали гидрофобность для каждого положения, используя индекс гидрофобности аминокислот ⁴² и усредненную гидрофобность по скользящему окну из семи аминокислот. Предыдущие структурные исследования структуры IFITM3 ⁴³ показали, что существует только один трансмембранный домен 2, который вставлен в мембрану. На основании этого доказательства мы использовали топологию, показанную на дополнительном рис. 9, в качестве начальной структуры.TM1 был создан в виде структуры α-спирали, а мотивы CRAC и линкерная область были построены в виде полностью вытянутой цепи. Линкерная область была ослаблена с использованием 5000 шагов крупнозернистого моделирования с использованием программы GROMACS ⁴⁴ с силовым полем Мартини ⁴⁵ для снятия напряжения в системе. Затем мы добавили область TM2 в виде спирали и вставили TM2 в двойной слой, имитирующий клеточную мембрану ⁴⁶ . Состав и соотношение липидов для смешанного бислоя POPC: DOPC: POPE: DOPE: CHOL: Sph: GM1 = 0.2: 0,2: 0,05: 0,05: 0,25: 0,15: 0,1 для внешней створки бислоя и 0,05: 0,05: 0,20: 0,2: 0,08: 0,08: 0,25: 0,03: 0,03: 0,03 POPC: DOPC: POPE: DOPE: POPS: DOPS: CHOL: PIP1: PIP2: PIP3 для внутренней листовки. Мы создали три возможных стартовых установки для смешанного липидного бислоя с водой в верхней и внутренней областях с помощью CHARMM-GUI ^47,48 . Заряды в системе нейтрализовали 0,15 М NaCl. Мы использовали девять повторов структуры белка IFITM3 в боксе для моделирования (дополнительный рис.9а). Первоначальная конфигурация была минимизирована с использованием самого крутого приличного метода для 5000 шагов, а затем уравновешена в ансамбле NPT в течение 5 нс при температуре 303 К и давлении 1 бар. Температура контролировалась термостатом Берендсена ⁴⁹ с константой связи 1 пс, а давление регулировалось баростатом Берендсена ⁴⁹ полуизотропного типа с константой связи 5 пс и сжимаемостью 3 × 10 ^−4. бар ^-1 . Поле реакции кулон ⁵⁰ было применено для описания электростатики с отсечкой на 1.1 нм. Предельное значение для ван-дер-ваальсовых взаимодействий также составляло 1,1 нм. Мы использовали интегратор Leap-frog и шаг по времени 20 фс для интегрирования. Все системы сольватировали в модели крупнозернистой воды, принятой в воде силового поля Мартини, нейтрализованной 0,15 М NaCl. Для каждой из трех исходных конформаций липидного бислоя было выполнено моделирование продукции в течение 10 мкс. Последние 1 мкс траектории от каждой из трех установок были использованы для анализа складчатой ​​структуры области CRAC1 – основной патч – CRAC2 модели IFITM3.Мы сгруппировали конформации IFITM3 по пороговому значению среднеквадратичного отклонения 0,3 нм в основных крупнозернистых частицах в крупнозернистом моделировании. Мы проанализировали паттерны связывания PIP2 и PIP3 в этом наиболее населенном конформационном кластере. Мы наблюдали, что и PIP2, и PIP3 конкурируют за «основной участок» остатков, показанный в аминокислотной последовательности на рис. 9 с расширенными данными. Мы извлекли три снимка из этого конформационного кластера, которые представляют самые разные паттерны связывания PIP2 и PIP3.

Подробная информация о моделировании молекулярной динамики всех атомов для связывания фосфолипидов

Чтобы лучше понять подробную конформацию связывания PIP2 и PIP3 с IFITM3 и рассчитать их энергии связывания с IFITM3, мы преобразовали три снимка, извлеченные из крупнозернистого моделирования в систему all-atom с помощью инструментов Martini ⁵¹ . Три выбранных снимка были вырезаны в поле 9 × 9 нм ² с центром в блоке IFITM3 из крупнозернистого моделирования, чтобы сохранить локальную оптимизированную липидную среду.Липид и белок были преобразованы в модель, полностью состоящую из атомов, и были преобразованы в симуляционный бокс 9 × 9 × 9 нм ³ , нейтрализованный 0,15 М NaCl. Расширенные данные На рис. 9 показано подробное взаимодействие между PIP2 или PIP3 с белком IFITM3 при разрешении всех атомов на этих снимках. Полностью атомное моделирование проводилось с использованием пакета GROMACS ⁴⁴ и силового поля CHARMM36 ⁵² с моделью воды TIP3. Несвязывающие взаимодействия были рассчитаны с отсечкой 12 Å, и для решения дальнодействующих ван-дер-ваальсовых взаимодействий был применен метод Эвальда ⁵¹ частиц-сетки.Каждую систему постепенно нагревали до 310 К со случайными начальными скоростями, выбранными из распределения Больцмана. Процесс нагрева длился 1 нс, температура контролировалась термостатом Нозе – Гувера ⁵³ , после чего следовало 30 нс уравновешивания в ансамбле NPT с ограничениями гармонического положения на тяжелых атомах белка. Давление поддерживали на уровне 1 бар в полуизотропной среде, контролируемом методом Парринелло – Рахмана. Сдерживающая сила постепенно снижалась с 5 ккал / моль до 0 ккал / моль с шагом -1 ккал / моль на окно в 5 нс.Заключительный кадр уравновешивания был взят для производственного цикла. Производственный цикл был выполнен дважды по 50 нс каждый, с двумя разными случайными начальными скоростями, назначенными уравновешенной конструкции. Был использован шаг интегрирования 2 фс. Энергия взаимодействия между PIP3 и белком IFITM3 рассчитывалась как сумма электростатической кулоновской энергии и потенциальной энергии Ван-дер-Ваальса, усредненных по двум траекториям продолжительностью 50 нс, всего 100 нс.

Взаимодействие PIP3 с двумя участками основных остатков

Анализы активации PIP3-связывания и AKT-сигнализации показали, что мутация участка K83 / K104 на K83A / K104A имела более высокий эффект, чем мутация участка R85 / R87 / K88 на R85A / R87A / K88A.Чтобы дополнительно проверить разницу в силе взаимодействия между PIP3 и двумя базовыми патчами, мы преобразовали все PIP1 и PIP2 в окне моделирования в PIP3. Далее мы выполнили моделирование на IFITM3 (K83A / K104A) и IFITM3 (R85A / R87A / K88A) в окне моделирования только для PIP3. Начиная с этой структуры, мы выполнили уравновешивание системы и 5 моделирования производства полностью атомной молекулярной динамики (каждое длительностью 200 нс), используя протокол для моделирования полностью атомной молекулярной динамики, описанный в разделе «Подробности моделирования полностью атомной молекулярной динамики. для связывания фосфолипидов ».Мы агрегировали последние 100 нс траекторий моделирования из каждого из 5 прогонов, которые мы добавили к 500 нс траекторий моделирования молекулярной динамики для анализа. Мы рассчитали энергию взаимодействия как сумму электростатических кулоновских и ван-дер-ваальсовых потенциальных энергий между PIP3 и остатками, образующими только базовый участок (K83 / K104 или R85 / R87 / K88). Энергии взаимодействия усреднялись по 500 нс агрегированных траекторий молекулярно-динамического моделирования для каждой системы. Мы повторили эти расчеты энергии взаимодействия для IFITM3 дикого типа и для мутантных конструкций K83A / K104A и R85A / R87A / K88A.

Расчеты тепловой карты контактной частоты на основе моделирования молекулярной динамики

Важной информацией, которую можно извлечь из моделирования молекулярной динамики, является временная частота контактов PIP3 с двумя основными остаточными пятнами. Постоянство этих взаимодействий играет важную роль в накоплении PIP3 с помощью IFITM3. Мы рассчитали процент снимков молекулярной динамики, которые показывают контакты между каждым из остатков в основном пластыре. Это называется контактной частотой.Мы также рассчитали процент снимков молекулярной динамики, которые показывают одновременные контакты PIP3 с двумя или более остатками в двух участках основных остатков. Мы создали тепловую карту, используя частоты, рассчитанные для IFITM3 дикого типа и у мутантов аланина.

Количественная ПЦР в реальном времени

Костный мозг здорового донора окрашивали и сортировали, как описано ранее. ⁵⁴ . Тотальную РНК из клеток экстрагировали с помощью набора для выделения РНК от Macherey – Nagel.Комплементарная ДНК была создана с помощью qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием FAST SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) и системы ПЦР в реальном времени Vii7 (Applied Biosystems) в соответствии со стандартными условиями ПЦР. COX6B использовали в качестве контрольного гена.

Измерения акустического рассеяния

Акустическое рассеяние, нормализованное по размеру одной ячейки (SNACS), было измерено с использованием ранее установленного микрофлюидного метода, который, как было показано, особенно чувствителен к жесткости клеточной поверхности ⁵⁵ .Полную информацию об измерениях можно найти в предыдущей публикации ⁵⁵ . Вкратце, клетки протекали через стоячую акустическую волну, генерируемую внутри вибрирующего подвешенного микроканального резонатора (SMR). SMR — это консольный инструмент для измерения массы ⁵⁶ , который также может обнаруживать акустическое рассеяние от ячеек, когда ячейки проходят через акустическую волну. Частота колебаний кантилевера отслеживалась, и ее смещение использовалось для количественной оценки акустического рассеяния от ячеек, а также плавучей массы ячеек.Перед проведением серии измерений SMR очищали 0,25% трипсином – ЭДТА в течение 20 минут, затем использовали 5% отбеливатель в течение 3 минут, а затем 5-минутное полоскание деионизированным H ₂ O для удаления стойкого биологического мусора. . После очистки SMR пассивировали 1 мг / мл PLL-g-PEG в H ₂ O в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим 5-минутным промыванием нормальной средой для культивирования клеток. Во время измерения все образцы загружали в SMR через трубку из фторированного этиленпропилена с внутренним диаметром 0,005 дюйма.Поток жидкости через SMR управлялся тремя независимыми электронными регуляторами давления и тремя соленоидными клапанами. Постоянный перепад давления был приложен к SMR для поддержания постоянного сдвига и скорости передачи данных для измерения ячейки. Данные, отображаемые на рис. 8a в расширенных данных, были получены с использованием кантилевера длиной 350 мкм с размером канала 15 × 20 мкм внутри кантилевера и временем прохождения через кантилевер примерно 200 мс. Все регуляторы, клапаны и сбор данных контролировались специальным программным обеспечением, написанным в LabVIEW 2017 (National Instruments), как подробно описано в предыдущей публикации ⁵⁵ .Параллельное измерение объема с использованием счетчика Коултера (Beckman Coulter) было выполнено для количественной оценки среднего объема клеток, которое использовалось вместе с измерениями плавучей массы одной клетки для расчета SNACS для каждой клетки, как сообщалось ранее ⁵⁵ . Все измерения проводили в нормальной среде для культивирования клеток при комнатной температуре в течение 10 мин после извлечения клеток из инкубатора для культивирования клеток. После измерения необработанных клеток Jeko1 из инкубатора был получен новый участок тех же клеток, обработанный 10 мкг мл ^-1 F (ab ‘) ₂ фрагмент козьей античеловеческой μ-цепи (Jackson Immunoresearch) и клетки немедленно (в течение примерно 1 мин) загружали в SMR для измерения.Клетки Jeko1, обработанные антителами, измеряли в течение примерно 7 минут, чтобы убедиться, что изменения, стимулированные античеловеческой μ-цепью, не были обращены в течение эксперимента. SMR кратковременно промывали PBS между экспериментами. Клетки Jeko1 дикого типа также измеряли после фиксации для получения положительного контроля жесткости клеток. Для фиксации клетки дважды промывали PBS, смешивали с 8% PFA в течение 30 мин, дважды промывали PBS и хранили при 4 ° C перед измерениями акустического рассеяния.

Количественная оценка и статистический анализ

Данные представлены в виде среднего значения ± s.d. если не указано иное. Статистический анализ был выполнен с помощью GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) с использованием непарного двустороннего теста t или как указано в подписях к рисункам. Значимость считалась P <0,05. Для экспериментов по трансплантации in vivo минимальное количество мышей в каждой группе было рассчитано с использованием функции «cpower» в пакете Hmisc Р. Каплана-Мейера. Анализ выживаемости был использован для оценки общей выживаемости с помощью GraphPad Prism 7. Mantel-Cox. Логранговый тест использовался для сравнения разницы между двумя группами.Мышей не исключали. Для анализа общей выживаемости пациентов пациенты в каждом наборе данных были разделены на две группы в зависимости от того, была ли их экспрессия выше или ниже среднего уровня IFITM3 , а для оценки общей выживаемости использовался анализ выживаемости Каплана-Мейера. Используемые наборы данных включают данные о результатах пациентов для B-ALL (Детская онкологическая группа (COG) P9906, n = 207; Восточная кооперативная онкологическая группа (ECOG) E2993, n = 83; и St Jude, n = 15), лимфома из клеток мантии (Проект молекулярного профилирования лимфомы / лейкемии (LLMPP), n = 92) и острый миелоидный лейкоз (Атлас ракового генома (TCGA), n = 200).Для сравнения различий в выживаемости между группами пациентов использовался лог-ранговый тест. Пакет R «выживаемость» (версия 2.35-8) использовался для анализа выживаемости и модель регрессии пропорциональных рисков Кокса в пакете R для многомерного анализа (https://www.r-project.org/). Исследователи не были закрыты для распределения во время экспериментов и оценки результатов. Эксперименты повторяли для обеспечения воспроизводимости наблюдений.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этим документом.

Что такое стабилизатор напряжения и как он работает? Типы стабилизаторов

Внедрение технологии микропроцессорных микросхем и силовых электронных устройств в конструкцию интеллектуальных стабилизаторов напряжения переменного тока (или автоматических регуляторов напряжения (AVR)) привело к получению высоких -качественное, стабильное электроснабжение при значительных и продолжительных отклонениях сетевого напряжения.

В качестве усовершенствования традиционных стабилизаторов напряжения релейного типа в современных инновационных стабилизаторах используются высокопроизводительные цифровые схемы управления и полупроводниковые схемы управления, которые исключают регулировку потенциометра и позволяют пользователю устанавливать требования к напряжению с помощью клавиатуры, с возможностью запуска и остановки выхода.

Это также привело к тому, что время срабатывания или чувствительность стабилизаторов стали намного меньше, обычно менее нескольких миллисекунд, кроме того, это можно регулировать с помощью переменной настройки.В настоящее время стабилизаторы стали оптимизированным решением для питания многих электронных устройств, чувствительных к колебаниям напряжения, и они нашли работу со многими устройствами, такими как станки с ЧПУ, кондиционеры, телевизоры, медицинское оборудование, компьютеры, телекоммуникационное оборудование и т. Д.

Это электрический прибор, который предназначен для подачи постоянного напряжения на нагрузку на своих выходных клеммах независимо от изменений входного или входящего напряжения питания.Он защищает оборудование или машину от перенапряжения, пониженного напряжения и других скачков напряжения.

Также называется автоматический регулятор напряжения (АРН) . Стабилизаторы напряжения предпочтительны для дорогостоящего и драгоценного электрического оборудования, поскольку они защищают его от вредных колебаний низкого / высокого напряжения. Некоторое из этого оборудования — кондиционеры, офсетные печатные машины, лабораторное оборудование, промышленные машины и медицинское оборудование.

Стабилизаторы напряжения регулируют колебания входного напряжения до того, как оно может быть подано на нагрузку (или оборудование, чувствительное к колебаниям напряжения).Выходное напряжение стабилизатора будет оставаться в диапазоне 220 В или 230 В в случае однофазного питания и 380 В или 400 В в случае трехфазного питания в пределах заданного диапазона колебаний входного напряжения. Это регулирование осуществляется с помощью понижающих и повышающих операций, выполняемых внутренней схемой.

На современном рынке доступно огромное количество разнообразных автоматических регуляторов напряжения. Это могут быть одно- или трехфазные блоки в зависимости от типа применения и необходимой мощности (кВА).Трехфазные стабилизаторы выпускаются в двух версиях: модели со сбалансированной нагрузкой и модели с несбалансированной нагрузкой.

Они доступны либо в виде отдельных блоков для бытовых приборов, либо в виде больших стабилизаторов для целых приборов в определенном месте, например, во всем доме. Кроме того, это могут быть стабилизаторы аналогового или цифрового типа.

К распространенным типам стабилизаторов напряжения относятся стабилизаторы с ручным управлением или с переключением, автоматические стабилизаторы релейного типа, твердотельные или статические стабилизаторы и стабилизаторы с сервоуправлением.В дополнение к функции стабилизации большинство стабилизаторов имеют дополнительные функции, такие как отсечка низкого напряжения на входе / выходе, отсечка высокого напряжения на входе / выходе, отсечка при перегрузке, возможность запуска и остановки выхода, ручной / автоматический запуск, отображение отсечки напряжения, переключение при нулевом напряжении. и др.

Как правило, каждое электрическое оборудование или устройство рассчитано на широкий диапазон входного напряжения. В зависимости от чувствительности рабочий диапазон оборудования ограничен определенными значениями, например, одно оборудование может выдерживать ± 10 процентов номинального напряжения, а другое — ± 5 процентов или меньше.

Колебания напряжения (повышение или понижение величины номинального напряжения) довольно часто встречаются во многих областях, особенно на оконечных линиях. Наиболее частые причины колебаний напряжения — это освещение, неисправности электрооборудования, неисправная проводка и периодическое отключение устройства. Эти колебания приводят к поломке электрического оборудования или приборов.

Результатом длительного перенапряжения

• Необратимое повреждение оборудования
• Повреждение изоляции обмоток
• Нежелательное прерывание нагрузки
• Повышенные потери в кабелях и сопутствующем оборудовании
• Снижение срока службы устройства

Длительное понижение напряжения приведет к

• Неисправность оборудования
• Более длительные периоды работы (как в случае резистивных нагревателей)
• Снижение производительности оборудования
• Получение больших токов, которые в дальнейшем приводят к перегреву
• Ошибки вычислений
• Пониженная скорость двигателей

Таким образом, стабильность и точность напряжения определяют правильную работу оборудования.Таким образом, стабилизаторы напряжения гарантируют, что колебания напряжения на входящем источнике питания не повлияют на нагрузку или электрический прибор.

Основной принцип стабилизатора напряжения для выполнения операций понижения и повышения

В стабилизаторе напряжения коррекция напряжения при повышенном и пониженном напряжении выполняется с помощью двух основных операций, а именно: b oost и операции понижения . Эти операции могут выполняться вручную с помощью переключателей или автоматически с помощью электронных схем.В условиях пониженного напряжения режим повышения напряжения увеличивает напряжение до номинального уровня, в то время как понижающий режим снижает уровень напряжения во время состояния повышенного напряжения.

Концепция стабилизации включает в себя добавление или вычитание напряжения в сети и из нее. Для выполнения такой задачи в стабилизаторе используется трансформатор, который в различных конфигурациях соединен с переключающими реле. В некоторых стабилизаторах используется трансформатор с отводами на обмотке для обеспечения различных коррекций напряжения, в то время как в сервостабилизаторах используется автотрансформатор для обеспечения широкого диапазона коррекции.

Чтобы понять эту концепцию, давайте рассмотрим простой понижающий трансформатор с номиналом 230 / 12В и его связь с этими операциями приведена ниже.

На рисунке выше показана конфигурация повышения, в которой полярность вторичной обмотки ориентирована таким образом, что ее напряжение напрямую добавляется к первичному напряжению. Следовательно, в случае пониженного напряжения трансформатор (будь то переключение ответвлений или автотрансформатор) переключается с помощью реле или твердотельных переключателей, так что к входному напряжению добавляются дополнительные вольты.

На приведенном выше рисунке трансформатор подключен в компенсирующей конфигурации, в которой полярность вторичной катушки ориентирована таким образом, что ее напряжение вычитается из первичного напряжения. Схема переключения переключает соединение с нагрузкой в ​​эту конфигурацию во время состояния перенапряжения.

На рисунке выше показан двухступенчатый стабилизатор напряжения, в котором используются два реле для обеспечения постоянной подачи переменного тока на нагрузку во время перенапряжения и в условиях напряжения. Путем переключения реле могут выполняться операции понижения и повышения для двух конкретных колебаний напряжения (одно находится под напряжением, например, 195 В, а другое — при повышенном напряжении, например, 245 В).

В случае стабилизаторов ответвительного трансформаторного типа, различные ответвления переключаются в зависимости от требуемой величины повышающего или понижающего напряжения. Но в случае стабилизаторов автотрансформаторного типа двигатели (серводвигатели) используются вместе со скользящим контактом для получения повышающего или понижающего напряжения от автотрансформатора, поскольку он содержит только одну обмотку.

Стабилизаторы напряжения стали неотъемлемой частью многих бытовых, промышленных и коммерческих электроприборов.Раньше использовались ручные или переключаемые стабилизаторы напряжения для повышения или понижения входящего напряжения, чтобы обеспечить выходное напряжение в желаемом диапазоне. Такие стабилизаторы построены с электромеханическими реле в качестве переключающих устройств.

Позже, дополнительная электронная схема автоматизирует процесс стабилизации, и на свет появились автоматические регуляторы напряжения РПН. Другой популярный тип стабилизатора напряжения — сервостабилизатор, в котором коррекция напряжения осуществляется непрерывно без какого-либо переключателя.Обсудим три основных типа стабилизаторов напряжения.

В стабилизаторах напряжения этого типа регулирование напряжения осуществляется переключением реле таким образом, чтобы одно из нескольких ответвлений трансформатора подключалось к нагрузке (как описано выше) независимо от того, он предназначен для работы в режиме наддува или противодействия. На рисунке ниже показана внутренняя схема стабилизатора релейного типа.

Он имеет электронную схему и набор реле, помимо трансформатора (который может быть трансформатором с тороидальным или железным сердечником с отводами на его вторичной обмотке).Электронная схема включает схему выпрямителя, операционный усилитель, микроконтроллер и другие крошечные компоненты.

Электронная схема сравнивает выходное напряжение с эталонным значением, обеспечиваемым встроенным источником эталонного напряжения. Всякий раз, когда напряжение повышается или опускается ниже эталонного значения, схема управления переключает соответствующее реле для подключения к выходу требуемого ответвления.

Эти стабилизаторы обычно изменяют напряжение при колебаниях входного напряжения от ± 15 процентов до ± 6 процентов с точностью выходного напряжения от ± 5 до ± 10 процентов.Этот тип стабилизаторов наиболее часто используется для низкоуровневых бытовых приборов в жилых, коммерческих и промышленных помещениях, поскольку они имеют малый вес и низкую стоимость. Однако они страдают от нескольких ограничений, таких как низкая скорость коррекции напряжения, меньшая долговечность, меньшая надежность, прерывание цепи питания во время регулирования и неспособность выдерживать высокие скачки напряжения.

Их просто называют сервостабилизаторами (работа с сервомеханизмом, который также известен как отрицательная обратная связь), и название предполагает, что он использует серводвигатель для коррекции напряжения.Они в основном используются для обеспечения высокой точности выходного напряжения, обычно ± 1% при изменении входного напряжения до ± 50%. На рисунке ниже показана внутренняя схема сервостабилизатора, который включает в себя серводвигатель, автотрансформатор, повышающий трансформатор, драйвер двигателя и схему управления в качестве основных компонентов.

В этом стабилизаторе один конец первичной обмотки понижающего повышающего трансформатора соединен с фиксированным ответвлением автотрансформатора, а другой конец соединен с подвижным рычагом, которым управляет серводвигатель.Вторичная обмотка понижающего повышающего трансформатора соединена последовательно с входящим источником питания, который представляет собой не что иное, как выход стабилизатора.

Электронная схема управления обнаруживает провал и рост напряжения путем сравнения входного сигнала со встроенным источником опорного напряжения. Когда схема обнаруживает ошибку, она приводит в действие двигатель, который, в свою очередь, перемещает рычаг автотрансформатора. Он может питать первичную обмотку повышающего трансформатора, так что напряжение на вторичной обмотке должно быть желаемым выходным напряжением.Большинство сервостабилизаторов используют встроенный микроконтроллер или процессор для схемы управления для достижения интеллектуального управления.

Эти стабилизаторы могут быть однофазными, трехфазными симметричными или трехфазными несимметричными. В однофазном исполнении серводвигатель, соединенный с регулируемым трансформатором, обеспечивает коррекцию напряжения. В случае трехфазного симметричного типа серводвигатель соединен с тремя автотрансформаторами, так что стабилизированный выход обеспечивается во время колебаний путем регулировки выхода трансформаторов.В несбалансированном типе сервостабилизаторов три независимых серводвигателя соединены с тремя автотрансформаторами и имеют три отдельные цепи управления.

Сервостабилизаторы обладают различными преимуществами по сравнению со стабилизаторами релейного типа. Некоторые из них — более высокая скорость коррекции, высокая точность стабилизированного выхода, способность выдерживать броски тока и высокая надежность. Однако они требуют периодического обслуживания из-за наличия двигателей.

Как следует из названия, стабилизатор статического напряжения не имеет движущихся частей в качестве механизма серводвигателя в случае сервостабилизаторов.Он использует схему силового электронного преобразователя для стабилизации напряжения, а не вариацию в случае обычных стабилизаторов. С помощью этих стабилизаторов можно добиться большей точности и отличного регулирования напряжения по сравнению с сервостабилизаторами, и обычно регулирование составляет ± 1 процент.

По сути, он состоит из повышающего трансформатора, преобразователя мощности IGBT (или преобразователя переменного тока в переменный) и микроконтроллера, микропроцессора или контроллера на базе DSP. Преобразователь IGBT, управляемый микропроцессором, генерирует соответствующее количество напряжения с помощью метода широтно-импульсной модуляции, и это напряжение подается на первичную обмотку повышающего трансформатора.Преобразователь IGBT вырабатывает напряжение таким образом, что оно может быть синфазным или сдвинутым на 180 градусов по фазе входящего линейного напряжения, чтобы выполнять сложение и вычитание напряжений во время колебаний.

Каждый раз, когда микропроцессор обнаруживает провал напряжения, он посылает импульсы ШИМ на преобразователь IGBT, так что он генерирует напряжение, равное величине отклонения от номинального значения. Этот выход находится в фазе с входящим питанием и подается на первичную обмотку повышающего трансформатора.Поскольку вторичная обмотка подключена к входящей линии, индуцированное напряжение будет добавлено к входящему источнику питания, и это скорректированное напряжение будет подаваться на нагрузку.

Точно так же повышение напряжения заставляет схему микропроцессора посылать импульсы ШИМ таким образом, что преобразователь выводит напряжение с отклоненной величиной, которое на 180 градусов не совпадает по фазе с входящим напряжением. Это напряжение на вторичной обмотке понижающего вольтодобавочного трансформатора вычитается из входного напряжения, так что выполняется понижающая операция.

Эти стабилизаторы очень популярны по сравнению со стабилизаторами с переключением отводов и сервоуправляемыми стабилизаторами из-за большого количества преимуществ, таких как компактный размер, очень быстрая скорость коррекции, отличное регулирование напряжения, отсутствие технического обслуживания из-за отсутствия движущихся частей, высокая эффективность и высокая надежность.

Здесь возникает серьезный, но сбивающий с толку вопрос: в чем именно разница (я) между стабилизатором и регулятором ? Хорошо.. Оба выполняют одно и то же действие, которое заключается в стабилизации напряжения, но основная разница между стабилизатором напряжения и регулятором напряжения составляет :

Стабилизатор напряжения: Это устройство или схема, которые предназначены для подачи постоянного напряжения на выход без изменений по входящему напряжению.

Регулятор напряжения: Это устройство или схема, предназначенная для подачи постоянного напряжения на выход без изменения тока нагрузки.

Прежде всего, необходимо учесть несколько факторов, прежде чем покупать стабилизатор напряжения для прибора.Эти факторы включают в себя мощность, требуемую для устройства, уровень колебаний напряжения, которые наблюдаются в зоне установки, тип устройства, тип стабилизатора, рабочий диапазон стабилизатора (на который стабилизатор подает правильное напряжение), отключение по перенапряжению / пониженному напряжению, тип схема управления, тип монтажа и другие факторы. Здесь мы привели основные шаги, которые следует учитывать перед покупкой стабилизатора для вашего приложения.

• Проверьте номинальную мощность устройства, которое вы собираетесь использовать со стабилизатором, наблюдая за данными на паспортной табличке (вот образцы: паспортная табличка трансформатора, паспортная табличка MCB, паспортная табличка конденсатора и т. Д.) Или из руководства пользователя продукта.
• Поскольку стабилизаторы рассчитаны на кВА (то же, что и в случае трансформатора с номинальной мощностью в кВА, а не кВт), также можно рассчитать мощность, просто умножив напряжение прибора на максимальный номинальный ток.
• Рекомендуется добавить запас прочности к номиналу стабилизатора, обычно 20-25 процентов. Это может быть полезно для будущих планов по добавлению дополнительных устройств к выходу стабилизатора.
• Если прибор рассчитан в ваттах, учитывайте коэффициент мощности при расчете номинальной мощности стабилизатора в кВА.Напротив, если стабилизаторы рассчитаны в кВт, а не в кВА, умножьте коэффициент мощности на произведение напряжения и тока.

ниже — это решение под напряжением. Пример как выбрать стабилизатор напряжения подходящего размера для вашего электрического прибора (ов)

Предположим, если прибор (кондиционер или холодильник) рассчитан на 1 кВА. Следовательно, безопасный запас в 20 процентов составляет 200 Вт. Прибавив эти ватты к фактической мощности, мы получим мощность 1200 ВА. Поэтому для устройства предпочтительнее стабилизатор на 1,2 кВА или 1200 ВА.Для домашних нужд предпочтительны стабилизаторы от 200 ВА до 10 кВА. А для коммерческих и промышленных применений используются одно- и трехфазные стабилизаторы большой мощности.

Надеемся, что представленная информация будет информативной и полезной для читателя. Мы хотим, чтобы читатели выразили свое мнение по этой теме и ответили на этот простой вопрос — какова цель функции связи RS232 / RS485 в современных стабилизаторах напряжения — в разделе комментариев ниже.

% PDF-1.5 % 4024 0 объект > эндобдж xref 4024 81 0000000016 00000 н. 0000016572 00000 п. 0000016689 00000 п. 0000017339 00000 п. 0000017378 00000 п. 0000017493 00000 п. 0000022355 00000 п. 0000026881 00000 п. 0000031670 00000 п. 0000031756 00000 п. 0000032283 00000 п. 0000032850 00000 п. 0000033467 00000 п. 0000033991 00000 п. 0000034552 00000 п. 0000035019 00000 п. 0000035107 00000 п. 0000035220 00000 п. 0000040867 00000 п. 0000046275 00000 п. 0000050455 00000 п. 0000050548 00000 п. 0000051027 00000 п. 0000051631 00000 п. 0000051716 00000 п. 0000052234 00000 п. 0000052833 00000 п. 0000052862 00000 п. 0000053163 00000 п. 0000053634 00000 п. 0000054133 00000 п. 0000054567 00000 п. 0000055089 00000 п. 0000055223 00000 п. 0000055643 00000 п. 0000056397 00000 п. 0000057155 00000 п. 0000057720 00000 п. 0000057829 00000 п. 0000058291 00000 п. 0000058812 00000 п. 0000059274 00000 п. 0000060080 00000 п. 0000060622 00000 п. 0000064350 00000 п. 0000068938 00000 п. 0000072353 00000 п. 0000075762 00000 п. 0000079760 00000 п. 0000079924 00000 н. 0000080188 00000 п. 0000083284 00000 п. 0000083369 00000 п. 0000083440 00000 п. 0000086090 00000 н. 0000091267 00000 п. 0000103785 00000 п. 0000113722 00000 н. 0000118860 00000 н. 0000122621 00000 н. 0000122995 00000 н. 0000123405 00000 н. 0000126690 00000 н. 0000127098 00000 н. 0000127613 00000 н. 0000127844 00000 н. 0000128232 00000 н. 0000128463 00000 н. 0000128614 00000 н. 0000128771 00000 н. 0000129159 00000 н. 0000129258 00000 н. 0000129415 00000 н. 0000129803 00000 н. 0000129902 00000 н. 0000130051 00000 н. 0000132407 00000 н. 0000140231 00000 п. 0000142331 00000 п. 0000149988 00000 н. 0000001916 00000 н. трейлер ] / Назад 7372730 >> startxref 0 %% EOF 4104 0 объект > поток h ܛ wXSgO $ @

Учебное пособие: настройка пиринга для канала Expressroute — Azure CLI

• 09.10.2020
• 8 минут на чтение

В этой статье

В этом руководстве показано, как создавать и управлять конфигурацией маршрутизации / пирингом для канала ExpressRoute в модели развертывания Resource Manager с помощью интерфейса командной строки.Вы также можете проверить состояние, обновить, удалить и отключить пиринги для канала ExpressRoute. Если вы хотите использовать другой метод для работы с вашей схемой, выберите артикул из следующего списка:

Из этого руководства вы узнаете, как:

• Настройка, обновление и удаление пиринга Microsoft для канала
• Настройка, обновление и удаление частного пиринга Azure для канала

Предварительные требования

• Перед началом установите последнюю версию команд CLI (2.0 или новее). Дополнительные сведения об установке команд интерфейса командной строки см. В разделе Установка интерфейса командной строки Azure.
• Перед началом настройки убедитесь, что вы ознакомились с предварительными условиями, требованиями к маршрутизации и страницами рабочего процесса.
• У вас должен быть активный канал ExpressRoute. Прежде чем продолжить, следуйте инструкциям по созданию канала ExpressRoute и включите канал у поставщика услуг подключения. Канал ExpressRoute должен находиться в подготовленном и включенном состоянии, чтобы вы могли выполнять команды из этой статьи.

Эти инструкции применимы только к цепям, созданным с поставщиками услуг, предлагающими услуги связи уровня 2. Если вы используете поставщика услуг, который предлагает управляемые услуги уровня 3 (обычно IPVPN, например MPLS), ваш провайдер подключения настроит и управляет маршрутизацией за вас.

Вы можете настроить частный пиринг и пиринг Microsoft для канала ExpressRoute. Пиринги можно настроить в любом порядке по вашему выбору. Однако вы должны убедиться, что выполняете настройку каждого пиринга по очереди.Дополнительные сведения о доменах маршрутизации и пиринге см. В разделе Домены маршрутизации ExpressRoute.

Пиринг Майкрософт

Этот раздел помогает создавать, получать, обновлять и удалять конфигурацию пиринга Microsoft для канала ExpressRoute.

Важно

При пиринге Microsoft каналов ExpressRoute, который был настроен до 1 августа 2017 г., все служебные префиксы будут объявляться через пиринг Microsoft, даже если фильтры маршрутов не определены. Пиринг Microsoft для каналов ExpressRoute, настроенных 1 августа 2017 г. или позднее, не будет иметь никаких префиксов, объявляемых до тех пор, пока к каналу не будет присоединен фильтр маршрута.Дополнительные сведения см. В разделе Настройка фильтра маршрута для пиринга Майкрософт.

Для создания пиринга Microsoft

1. Установите последнюю версию Azure CLI. Используйте последнюю версию интерфейса командной строки Azure (CLI).

     az войти
     

   Выберите подписку, для которой вы хотите создать канал ExpressRoute.

     az account set --subscription "<идентификатор подписки>"
     

2. Создайте канал ExpressRoute.Следуйте инструкциям, чтобы создать канал ExpressRoute и предоставить его поставщику подключения. Если ваш поставщик услуг подключения предлагает управляемые службы уровня 3, вы можете попросить своего поставщика услуг подключения включить для вас пиринг Microsoft. В этом случае вам не нужно будет следовать инструкциям, перечисленным в следующих разделах. Однако, если ваш провайдер подключения не управляет маршрутизацией за вас, после создания канала продолжите настройку, используя следующие шаги.

3. Проверьте канал ExpressRoute, чтобы убедиться, что он подготовлен и включен.Используйте следующий пример:

     az список сетевых экспресс-маршрутов
     

   Ответ аналогичен следующему примеру:

     "allowClassicOperations": false,
   "авторизации": [],
   "circuitProvisioningState": "Включено",
   "etag": "W / \" 1262c492-ffef-4a63-95a8-a6002736b8c4 \ "",
   "gatewayManagerEtag": ноль,
   «id»: «/subscriptions/81ab786c-56eb-4a4d-bb5f-f60329772466/resourceGroups/ExpressRouteResourceGroup/providers/Microsoft.Network/expressRouteCircuits/MyCircuit»,
   "location": "westus",
   "name": "MyCircuit",
   "пиринги": [],
   "provisioningState": "Успешно",
   "resourceGroup": "ExpressRouteResourceGroup",
   "serviceKey": "1d05cf70-1db5-419f-ad86-1ca62c3c125b",
   "serviceProviderNotes": нуль,
   "serviceProviderProperties": {
    "bandwidthInMbps": 200,
    "peeringLocation": "Кремниевая долина",
    "serviceProviderName": "Equinix"
   },
   "serviceProviderProvisioningState": "Предоставлено",
   "sku": {
    "family": "UnlimitedData",
    "name": "Standard_MeteredData",
    «уровень»: «Стандарт»
   },
   "теги": null,
   "тип": "Microsoft.Сеть / expressRouteCircuits]
     

4. Настройте пиринг Microsoft для канала. Прежде чем продолжить, убедитесь, что у вас есть следующая информация.

   • Подсеть A / 30 для первичного канала. Блок адресов должен быть действительным общедоступным префиксом IPv4, принадлежащим вам и зарегистрированным в RIR / IRR.
   Подсеть
   • A / 30 для вторичного канала. Блок адресов должен быть действующим общедоступным префиксом IPv4, принадлежащим вам и зарегистрированным в RIR / IRR.
   • Действительный идентификатор VLAN для установления этого пиринга.Убедитесь, что никакой другой пиринг в цепи не использует тот же идентификатор VLAN.
   • Номер AS для пиринга. Вы можете использовать как 2-байтовые, так и 4-байтовые номера AS.
   • Объявленные префиксы: укажите список всех префиксов, которые вы планируете рекламировать в сеансе BGP. Принимаются только префиксы общедоступных IP-адресов. Если вы планируете отправлять набор префиксов, вы можете отправить список, разделенный запятыми. Эти префиксы должны быть зарегистрированы для вас в RIR / IRR.
   • Необязательно — Клиентский ASN: Если вы рекламируете префиксы, которые не зарегистрированы для пирингового номера AS, вы можете указать номер AS, под которым они зарегистрированы.
   • Имя реестра маршрутизации: вы можете указать RIR / IRR, в котором регистрируются номер AS и префиксы.
   • Необязательно — Хеш MD5, если вы решите его использовать.

   Выполните следующий пример, чтобы настроить пиринг Microsoft для вашего канала:

     az network express-route peering create --circuit-name MyCircuit --peer-asn 100 --primary-peer-subnet 123.0.0.0/30 -g ExpressRouteResourceGroup --secondary-peer-subnet 123.0.0.4/30 - vlan-id 300 --peering-type MicrosoftPeering --advertised-public-prefixes 123.1.0.0 / 24
     

Для просмотра сведений о пиринге Microsoft

Вы можете получить подробную информацию о конфигурации, используя следующий пример:

  az network express-route peering show -g ExpressRouteResourceGroup --circuit-name MyCircuit --name AzureMicrosoftPeering
  

Важно

Microsoft проверяет, назначены ли вам указанные «Рекламируемые общедоступные префиксы» и «Peer ASN» (или «Клиентское ASN») в реестре маршрутизации Интернета.Если вы получаете общедоступные префиксы от другого объекта и если назначение не записано в реестре маршрутизации, автоматическая проверка не будет завершена и потребует проверки вручную. Если автоматическая проверка не удалась, вы увидите «AdvertisedPublicPrefixesState» как «Требуется проверка» в выходных данных приведенной выше команды.

Если вы видите сообщение «Требуется проверка», соберите документы, которые показывают, что общедоступные префиксы назначены вашей организации организацией, которая указана как владелец префиксов в реестре маршрутизации, и отправьте эти документы для проверки вручную. открыв заявку в службу поддержки.

Вывод аналогичен следующему примеру:

  {
  "azureAsn": 12076,
  "etag": "W / \" 2e97be83-a684-4f29-bf3c-96191e270666 \ "",
  "gatewayManagerEtag": "18",
  «id»: «/subscriptions/9a0c2943-e0c2-4608-876c-e0ddffd1211b/resourceGroups/ExpressRouteResourceGroup/providers/Microsoft.Network/expressRouteCircuits/MyCircuit/peerings/AzureMicrosoftPeering»
  "lastModifiedBy": "Клиент",
  "microsoftPeeringConfig": {
    "AdvertisedPublicPrefixes": [
        ""
      ],
     "AdvertisedPublicPrefixesState": "",
     "customerASN":,
     "routingRegistryName": ""
  }
  "name": "AzureMicrosoftPeering",
  "peerAsn":,
  "peeringType": "AzureMicrosoftPeering",
  "primaryAzurePort": "",
  "primaryPeerAddressPrefix": "",
  "provisioningState": "Успешно",
  "resourceGroup": "ExpressRouteResourceGroup",
  "routeFilter": null,
  "secondaryAzurePort": "",
  "secondaryPeerAddressPrefix": "",
  "sharedKey": нуль,
  "state": "Включено",
  "статистика": ноль,
  "vlanId": 100
}
  

Для обновления конфигурации пиринга Microsoft

Вы можете обновить любую часть конфигурации.Объявленные префиксы канала обновляются с 123.1.0.0/24 до 124.1.0.0/24 в следующем примере:

  az Обновление пиринга экспресс-маршрутов сети - имя-схемы MyCircuit -g ExpressRouteResourceGroup --peering-type MicrosoftPeering --advertised-public-prefixes 124.1.0.0/24
  

Для добавления настроек пиринга Microsoft IPv6 к существующей конфигурации IPv4

  az Обновление пиринга экспресс-маршрутов сети -g ExpressRouteResourceGroup --circuit-name MyCircuit --peering-type MicrosoftPeering --ip-version ipv6 --primary-peer-subnet 2002: db00 :: / 126 --secondary-peer- подсеть 2003: db00 :: / 126 --advertised-public-prefixes 2002: db00 :: / 126
  

Частный пиринг Azure

Этот раздел помогает создавать, получать, обновлять и удалять конфигурацию частного пиринга Azure для канала ExpressRoute.

Для создания частного пиринга Azure

1. Установите последнюю версию Azure CLI.

2.   az войти
     

   Выберите подписку, которую вы хотите создать, канал ExpressRoute

     az account set --subscription "<идентификатор подписки>"
     

3. Создайте канал ExpressRoute. Следуйте инструкциям, чтобы создать канал ExpressRoute и предоставить его поставщику подключения.Если ваш поставщик подключения предлагает управляемые службы уровня 3, вы можете попросить своего поставщика подключения включить для вас частный пиринг Azure. В этом случае вам не нужно будет следовать инструкциям, перечисленным в следующих разделах. Однако, если ваш провайдер подключения не управляет маршрутизацией за вас, после создания канала продолжите настройку, используя следующие шаги.

4. Проверьте канал ExpressRoute, чтобы убедиться, что он подготовлен и включен. Используйте следующий пример:

     az network express-route show --resource-group ExpressRouteResourceGroup --name MyCircuit
     

   Ответ аналогичен следующему примеру:

     "allowClassicOperations": false,
   "авторизации": [],
   "circuitProvisioningState": "Включено",
   "etag": "W / \" 1262c492-ffef-4a63-95a8-a6002736b8c4 \ "",
   "gatewayManagerEtag": ноль,
   «идентификатор»: «/ подписки / 81ab786c-56eb-4a4d-bb5f-f60329772466 / resourceGroups / ExpressRouteResourceGroup / Provider / Microsoft.Сеть / expressRouteCircuits / MyCircuit ",
   "location": "westus",
   "name": "MyCircuit",
   "пиринги": [],
   "provisioningState": "Успешно",
   "resourceGroup": "ExpressRouteResourceGroup",
   "serviceKey": "1d05cf70-1db5-419f-ad86-1ca62c3c125b",
   "serviceProviderNotes": нуль,
   "serviceProviderProperties": {
   "bandwidthInMbps": 200,
   "peeringLocation": "Кремниевая долина",
   "serviceProviderName": "Equinix"
   },
   "serviceProviderProvisioningState": "Предоставлено",
   "sku": {
    "family": "UnlimitedData",
    "name": "Standard_MeteredData",
    «уровень»: «Стандарт»
   },
   "теги": null,
   "тип": "Microsoft.Сеть / expressRouteCircuits]
     

5. Настройте частный пиринг Azure для канала. Прежде чем переходить к следующим шагам, убедитесь, что у вас есть следующие предметы:

   • Пара подсетей, не являющихся частью адресного пространства, зарезервированного для виртуальных сетей. Одна подсеть будет использоваться для первичного канала, а другая — для вторичного. В каждой из этих подсетей вы назначаете маршрутизатору первый пригодный для использования IP-адрес, поскольку Microsoft использует второй пригодный для использования IP-адрес для своего маршрутизатора.У вас есть три варианта для этой пары подсетей:
     • IPv4: Две / 30 подсетей.
     • IPv6: Две подсети / 126.
     • Обе: две подсети / 30 и две подсети / 126.
   • Действительный идентификатор VLAN для установления этого пиринга. Убедитесь, что никакой другой пиринг в цепи не использует тот же идентификатор VLAN.
   • Номер AS для пиринга. Вы можете использовать как 2-байтовые, так и 4-байтовые номера AS. Вы можете использовать частный номер AS для этого пиринга. Убедитесь, что вы не используете 65515.
   • Необязательно — Хеш MD5, если вы решите его использовать.

   Используйте следующий пример для настройки частного пиринга Azure для вашего канала:

     az network express-route peering create --circuit-name MyCircuit --peer-asn 100 --primary-peer-subnet 10.0.0.0/30 -g ExpressRouteResourceGroup --secondary-peer-subnet 10.0.0.4/30 - vlan-id 200 --peering-type AzurePrivatePeering
     

   Если вы решили использовать хэш MD5, используйте следующий пример:

     az network express-route peering create --circuit-name MyCircuit --peer-asn 100 --primary-peer-subnet 10.0.0.0 / 30 -g ExpressRouteResourceGroup --secondary-peer-subnet 10.0.0.4/30 --vlan-id 200 --peering-type AzurePrivatePeering --SharedKey "A1B2C3D4"
     

   Важно

   Убедитесь, что вы указали номер AS как одноранговый ASN, а не клиентский ASN.

Просмотр сведений о частном пиринге Azure

Вы можете получить подробную информацию о конфигурации, используя следующий пример:

  az network express-route peering show -g ExpressRouteResourceGroup --circuit-name MyCircuit --name AzurePrivatePeering
  

Вывод аналогичен следующему примеру:

  {
  "azureAsn": 12076,
  "etag": "W / \" 2e97be83-a684-4f29-bf3c-96191e270666 \ "",
  "gatewayManagerEtag": "18",
  «идентификатор»: «/ подписки / 9a0c2943-e0c2-4608-876c-e0ddffd1211b / resourceGroups / ExpressRouteResourceGroup / Provider / Microsoft.Сеть / expressRouteCircuits / MyCircuit / peerings / AzurePrivatePeering ",
  "ipv6PeeringConfig": ноль,
  "lastModifiedBy": "Клиент",
  «microsoftPeeringConfig»: нуль,
  "name": "AzurePrivatePeering",
  "peerAsn": 7671,
  "peeringType": "AzurePrivatePeering",
  "primaryAzurePort": "",
  "primaryPeerAddressPrefix": "",
  "provisioningState": "Успешно",
  "resourceGroup": "ExpressRouteResourceGroup",
  "routeFilter": null,
  "secondaryAzurePort": "",
  "secondaryPeerAddressPrefix": "",
  "sharedKey": нуль,
  "state": "Включено",
  "статистика": ноль,
  "vlanId": 100
}
  

Для обновления конфигурации частного пиринга Azure

Вы можете обновить любую часть конфигурации, используя следующий пример.В этом примере идентификатор VLAN канала обновляется со 100 до 500.

  az Обновление пиринга экспресс-маршрутов сети --vlan-id 500 -g ExpressRouteResourceGroup --circuit-name MyCircuit --name AzurePrivatePeering
  

Очистить ресурсы

Для удаления пиринга Microsoft

Вы можете удалить свою конфигурацию пиринга, выполнив следующий пример:

  az network express-route peering delete -g ExpressRouteResourceGroup --circuit-name MyCircuit --name MicrosoftPeering
  

Удаление частного пиринга Azure

Вы можете удалить свою конфигурацию пиринга, выполнив следующий пример:

Предупреждение

Перед запуском этого примера необходимо убедиться, что все виртуальные сети и подключения ExpressRoute Global Reach удалены.

  az network express-route peering delete -g ExpressRouteResourceGroup --circuit-name MyCircuit --name AzurePrivatePeering
  

Следующие шаги

После настройки частного пиринга Azure вы можете связать виртуальные сети с каналом, см .