Заправка углекислотой: Заправка углекислотой в Казани | Услуги

NRL разработала в лаборатории двухэтапный процесс преобразования CO2 и h3, собранных из морской воды, в жидкие углеводороды.На первом этапе был разработан катализатор на основе железа, который может достичь уровня конверсии CO2 до 60 процентов и снизить образование нежелательного метана с 97 до 25 процентов в пользу длинноцепочечных ненасыщенных углеводородов (олефинов).

На втором этапе эти олефины могут быть олигомеризованы (химический процесс, который превращает мономеры, молекулы с низким молекулярным весом, в соединение с более высоким молекулярным весом за счет конечной степени полимеризации) в жидкость, содержащую молекулы углеводородов в углероде C9-C16 диапазон, подходящий для преобразования в реактивное топливо с помощью катализатора на никелевой основе.

[mappress]
Источник: NRL, 26 сентября 2012 г.

Air Company производит ракетное топливо из захваченного CO2

Когда SpaceX запускает свою ракету Starship, предназначенную для отправки членов экипажа на Международную космическую станцию, доставки спутников в космос и полета на Марс уже в 2024 году, каждый запуск будет производить расчет 715 тонн CO2, примерно столько же, сколько 10 полетов по пересеченной местности на Боинге 747. Если космические полеты станут обычным явлением — и если ракета также будет использоваться для быстрых полетов вместо реактивных самолетов на Земле, — это может стать значимым источником выбросов.Но ракеты также могут использовать топливо с нулевым содержанием углерода.

[Изображение: Air Company] Air Company, стартап из Нью-Йорка, который превращает уловленный CO2 в продукты, запустил в конце 2019 года совершенно другое предложение — водку с отрицательным выбросом углерода. Но он увидел возможность начать производство ракетного топлива из захваченного CO2, когда его исследователи экспериментировали в лаборатории. «Мы обнаружили, что можем производить топливо очень эффективно, что произошло в результате несчастного случая», — говорит Стаффорд Шихан, электрохимик и соучредитель стартапа.«Мы работали с нашими системами при более высоких температурах, чем обычно, в некоторых условиях, которые мы обычно не делаем, и обнаружили, что можем очень эффективно производить эти молекулы топлива». Эта технология также может быть использована для производства углеродно-нейтрального топлива для некоторых других применений, таких как корабли, хотя компания сосредоточена на ракетном топливе.

[Изображение: Air Company] Создавая жидкий метан — топливо, используемое для новых ракет, таких как Starship — из уловленного CO2 вместо природного газа, чистый углеродный след каждого полета будет устранен.Топливо также решает вторую задачу: если многоразовые ракеты дойдут до Марса, им потребуется дозаправиться до полета домой, а топливо можно будет производить из материалов, найденных на планете. «[На] Марсе у вас есть вода, — говорит Шихан. «Он заморожен, но вы можете разморозить его, если у вас достаточно энергии для этого, и у вас есть энергия в виде солнечной энергии. И у вас много углекислого газа, потому что атмосфера на 95% состоит из CO2 ».

[Фото: Авиакомпания] Компания построила прототип, успешно создавший жидкий метан и жидкий кислород.«Мы сделали это и действительно тщательно изучили, как это работает», — говорит он. «Мы берем те знания, которые собираем на нашем первом предприятии, а затем разрабатываем прочный путь вперед в их масштабировании для использования на Марсе».

Следующими шагами будут проектирование и строительство заправочной станции и начало тесного сотрудничества с космической отраслью. «Нам нужно, чтобы отрасль пошла вместе с нами», — говорит он. «Хотя в прошлом мы получали финансирование от НАСА и надеемся сделать еще кое-что, мы действительно хотим, чтобы эти ключевые игроки и партнеры отрасли, такие как SpaceX и Blue Origin of the world, действительно помогли продвинуть эти технологии также продвигаются вперед.”

Границы | CO2 — внутренний продукт, необходимый субстрат и регуляторный триггер производственных процессов микробов и млекопитающих

Введение

Одно из наиболее решающих решений, которое необходимо принять при разработке новых биопроцессов, заключается в том, будет ли последний процесс проходить в анаэробных или аэробных условиях. В то время как значительно сниженные инвестиционные затраты говорят в пользу анаэробного производства, ожидаемая производительность и доступность внутриклеточной энергии являются движущими силами для аэробных подходов.Анаэробный метаболизм дает два чистых АТФ, образующихся при гликолизе, на глюкозу, в то время как аэробные аналоги могут достигать> 12 АТФ. Этот чистый выход АТФ даже представляет собой консервативную оценку с учетом истинного отношения АТФ к кислороду (P / O) 1: 1,3, что ниже теоретических максимумов 2–3. Следовательно, аэробные процессы часто являются первым выбором, если нацелено на образование продукта, вызывающего АТФ, с максимальной скоростью образования специфичных для клеток.

Двуокись углерода (CO ₂ ) является неизбежным продуктом процессов дыхания и поэтому всегда присутствует в аэробных биопроцессах.Это также верно для производства товаров, тонких химикатов или терапевтических белков с использованием микробов или клеток млекопитающих. В то время как терапевтические белки и химические вещества тонкой очистки обычно производятся в биореакторах размером 5–20 м ³ , производство товаров обычно осуществляется размером 50–500 м ³ или даже больше. Как внутреннее свойство, парциальные давления CO ₂ этих весов значительно отличаются от тех, которые обнаруживаются в лабораторных масштабах. Это явление является неотъемлемым следствием высокого абсолютного давления и плохих условий перемешивания в крупномасштабных биореакторах (Takors, 2012).

CO ₂ и его гидратированный аналог HCO3- могут не только служить субстратом или продуктом для реакций карбоксилирования и декарбоксилирования, эти виды могут также изменять физико-химические свойства белков, подкислять внутренний pH и регулировать вирулентность и выработку токсинов патогенами (Follonier и др., 2013). Следовательно, CO2 / HCO3- может взаимодействовать с клеточным метаболизмом и даже создавать сложные транскрипционные ответы. CO ₂ не только свободно диффундирует через клеточную мембрану (Gutknecht et al., 1977), он также может накапливаться в том же самом (Jones and Greenfield, 1982; Kuriyama et al., 1993; Bothun et al., 2004), тем самым увеличивая его проницаемость и текучесть, что в конечном итоге приводит к потенциально смертельному «эффекту анестезии». (Isenschmid et al., 1995).

Тот факт, что высокие уровни pCO ₂ используются для стерилизации пищевых продуктов (Ballestra et al., 1996; Spilimbergo and Bertucco, 2003; Garcia-Gonzalez et al., 2007), предполагает, что повышенные уровни pCO ₂ вряд ли улучшат производительность процессов производства микробов или млекопитающих.Вместо этого, как будет показано ниже, высокие уровни pCO ₂ часто совпадают с ухудшением характеристик биопроцесса. Следовательно, при тщательных масштабных исследованиях желательно учитывать анализ воздействий pCO ₂ , чтобы гарантировать одинаково хорошие результаты в крупномасштабном масштабе по сравнению с ожиданиями лабораторного масштаба. Это особенно верно для создания новых биопроцессов, которые являются результатом исследований системной метаболической инженерии, проводимых в лабораторных условиях.

Целью данной статьи является обзор фундаментальных свойств, источников и воздействия CO ₂ на производственные процессы микробов и млекопитающих.Он сводится к объединению основных частей головоломки о том, как CO2 / HCO3– взаимодействует с клетками-продуцентами. Это покажет, что многое уже сделано, но еще не все до конца понятно. Это особенно верно для регуляции клеточного метаболизма, где CO2 / HCO3-, по-видимому, до сих пор является недооцененным триггером.

Основы — Физико-химические свойства и массоперенос

Двуокись углерода (CO ₂ , молярная масса: 44,01 г / моль) представляет собой бесцветный газ линейной молекулярной формы без запаха с температурой плавления -56.6 ° С. Он присутствует в атмосфере Земли в виде микропримесей, в настоящее время его уровень составляет около 400 ppm с тенденцией к неуклонному увеличению (http://co2now.org/).

Растворимость в воде можно описать с помощью закона Генри.

с c _{CO2, L} и p _CO2 , кодирующими равновесные значения молярной концентрации растворенного CO ₂ в жидкости L и соответствующее парциальное давление CO ₂ , соответственно.Для чистой воды при 25 ° C приводится коэффициент Генри H _CO2 = 34,5 ммоль / барл (Stumm and Morgan, 1995). Использование корреляции Вант-Гоффа

температурная зависимость константы равновесия (здесь: коэффициент Генри H _CO2 ) может быть оценена с помощью стандартного изменения энтальпии реакции Δ H ⁰ , универсальной газовой постоянной R и абсолютная температура T , как показано.Примечательно, что K кодирует постоянную интегрирования, которая может быть получена из справочных данных, например, при 25 ° C. Используя уравнение (2), можно рассчитать H _CO2 ( T = 20 ° C) = 40 ммоль / барл и H _CO2 ( T = 37 ° C) = 25 ммоль / барл. . Уменьшение коэффициентов Генри [как определено в (1)] отражает уменьшение растворимости газа при повышении температуры — типичное явление для растворенных газов в данном диапазоне температур.

Помимо температуры, на растворимость CO ₂ также влияет концентрация электролита.Следуя эмпирическому подходу Сеченова (1889), можно учитывать отдельные вклады ионной силы для оценки итоговой растворимости газа в солесодержащей жидкости (Noorman et al., 1992). Однако состав ферментационной среды часто бывает сложным и постоянно меняется в процессе культивирования. Причинами являются образование продуктов и побочных продуктов, расход субстрата и добавление титрующих агентов. Поэтому наиболее практичным подходом является измерение растворимости CO ₂ в реальных средах для культивирования.Собственные экспериментальные наблюдения показывают, что реальные значения H _CO2 [согласно (1)] часто увеличиваются, могут даже удваиваться, по сравнению со значениями для чистой воды (неопубликованные данные).

При обычных условиях эксплуатации при культивировании микробов или млекопитающих выделяются выхлопные газы с объемными долями CO ₂ 5–25%. Для консервативной оценки можно предположить условия равновесия между газом и жидкостью со значениями H _CO2 для чистой воды при 37 ° C.Затем растворенный CO ₂ уровней c _{CO2, L} , вероятно, будет находиться в диапазоне от 75 до 375 мг / л. Например, Blombach et al. (2013) измерили уровень p _CO2 около 160 мбар (около 360 мг / л) в конце аэрированного (0,1 объемного объема) 1,5 бар периодического культивирования с перемешиванием с 5 г _CDW Corynebacterium glutamicum на л. Увеличение аэрации до 3 vvm снизило p _CO2 до 40 мбар (около 90 мг / л). Подобные значения наблюдались Buchholz et al.(2014b). Напротив, максимальная концентрация растворенного кислорода в атмосферных условиях обычно составляет 7,5–8 мг / л (опять же, в зависимости от состава среды). Следовательно, уровни растворенного CO ₂ намного превосходят уровни растворенного O ₂ . Этот вывод может быть еще более очевидным, если принять во внимание характеристики массопереноса (рис. 1).

Рисунок 1. Принципы массопереноса CO ₂ . CO ₂ выделяется клетками и переносится через окружающую жидкую пленку посредством диффузии.После выхода из этого слоя толщиной в несколько мкм растворенный CO ₂ попадает в зону хорошо перемешанного вещества и переносится к пузырькам посредством конвекции. Чтобы достичь пузырьков, растворенный CO ₂ должен снова пройти через окружающую пленку путем диффузии. Зонды для измерения растворенного CO ₂ или O ₂ устанавливаются в конвективной зоне, что дает соответствующий сигнал.

Рисунок 1 показывает, что максимальные уровни c _{CO2, L} обнаруживаются в ближайшем микроокружении клеток.По тренду датчики для измерения растворенного газа обнаруживают более низкие уровни. Это отличается от растворенного кислорода, где клетки сталкиваются с самыми низкими уровнями на пути массопереноса.

Хотя уровни растворенного углекислого газа могут достигать высоких значений ингибирования во время процесса ферментации, вместо этого начальные условия могут быть ограничивающими. При условии наличия равновесия между входящей аэрацией и жидкостью 0,5 мг _CO2 / л. Примечательно, что это низкое значение, вероятно, сохранится, если слишком высокая аэрация (с низкой концентрацией CO ₂ ) удаляет новый метаболически продуцируемый CO ₂ .Следовательно, анаплеротические реакции могут быть ограничены подачей субстрата (HCO3- / CO2) (см. Раздел «Метаболическое высвобождение и включение»), что в конечном итоге приведет к снижению роста клеток.

По аналогии с переносом кислорода, скорость переноса CO ₂ CTR (ммоль / л · ч) может быть описана следующим образом:

с k _L a _CO2 кодировка для CO ₂ коэффициент массопереноса (1 / час), cCO2, L * для растворенного CO ₂ концентрация в состоянии равновесия в соответствии с законом Генри (ммоль / L) и c _{CO2, L} представляет измеренную концентрацию (ммоль / л).

Истинное измерение k _L a _{Значения CO2} на практике довольно сложно. Один из подходов состоит в том, чтобы принять CTR = CER , т. Е. Интенсивность выбросов углекислого газа CER равна скорости очистки CTR CO ₂ . Путем уравновешивания потоков аэрации и выхлопных газов должны быть доступны соответствующие значения, и соответственно можно получить k _L a _CO2 . Тем не менее этот подход обнаруживает свой недостаток, когда культуры клеток млекопитающих сбалансированы.Здесь сигнал выхлопных газов представляет собой суперпозицию биологической активности и добавления CO ₂ для титрования. В качестве альтернативы, k _L a _CO2 может быть оценено из k _L a _O2 согласно следующему:

Уравнение (4) является результатом теории проникновения Хигби Хигби (1935) и модели возобновляемой поверхности Данквертса Данквертса (1951). По-видимому, коэффициент массопереноса для CO ₂ пропорционально связан с соотношением коэффициентов диффузии D для CO ₂ и O ₂ в воде.Поскольку значения k _L a _O2 относительно легко измерить, этот подход предлагает прямой доступ к k _L a _CO2 . Однако перенос CO ₂ принципиально отличается от переноса O ₂ , поскольку были учтены характеристики диссоциации (см. Рисунок 2).

Рис. 2. Равновесие диссоциации CO ₂ разновидностей в зависимости от pH .Были выбраны константы равновесия K ₁ = 10 ^−6,3 M и K ₂ = 10 ^−10,25 M. Подробности см. В тексте.

CO ₂ диссоциирует в воде в зависимости от pH следующим образом:

Поскольку равновесие диссоциации CO ₂ находится далеко на стороне ангидрида (99,8%), концентрации угольной кислоты H ₂ CO ₃ являются низкими, не превышая однозначных микромолярных диапазонов в типичных условиях культивирования.Следовательно, кажущаяся константа равновесия K ₁ (Bailey and Ollis, 1986):

сформулирован и дополнен Бейли и Оллисом (1986) следующим образом:

Можно смело предположить, что реакции (де-) протонирования формулы (5) протекают очень быстро. Однако предполагается, что образование и диссоциация угольной кислоты из CO ₂ ограничивают общий процесс уравновешивания. k ₁ и k ₋₁ были оценены как 0,03 1 / с и 20 1 / с, соответственно (Bailey and Ollis, 1986).

При типичных условиях культивирования (pH 7) 83,3% разновидностей CO ₂ присутствуют в виде HCO3- и только 16,7% в виде CO ₂ . Следовательно, концентрация HCO3- примерно в пять раз выше, чем концентрация CO ₂ . Это утверждение справедливо не только для среды культивирования, но и для внутриклеточных условий, поскольку клетки стремятся поддерживать свой внутриклеточный pH примерно на этом уровне.

Рисунок 3 подтверждает, что полное рассмотрение отдельных видов CO ₂ , HCO3- и CO32- имеет решающее значение для получения точных значений общего количества CO ₂ c _T , растворенного в ферментационной суспензии. Недавно Buchholz et al. (2014a) отметили, что игнорирование анионов приводит к углеродному разрыву около 20% в течение первых часов ферментации. Примечательно, что уровень растворенного CO ₂ не зависит от pH (см. Рисунок 3). Согласно закону Генри только парциальное давление (и солевые условия) может влиять на c _CO2 .Следовательно, крупномасштабные биореакторы, которые имеют высокое гидростатическое давление 1–1,5 бар, имеют более высокие уровни растворенного CO ₂ , чем сопоставимые лабораторные системы. Это не только вызывает регуляторные ответы в клетках, но также влияет на буферную способность крупномасштабной суспензии. Из-за повышенных уровней CO2 / HCO3- буферность pH значительно увеличивается в больших масштабах по сравнению с лабораторными ферментациями.

Рисунок 3. Распределение CO ₂ видов в воде при атмосферных условиях (25 ° C) .Даны виды согласно формуле (5), а также их сумма c _T [рисунок изменен по Бейли и Оллис (1986)].

Метаболическое высвобождение и включение

Метаболизм всех живых организмов обеспечивается набором карбоксилаз, включающих CO ₂ или бикарбонат (HCO3-) в органические молекулы, и декарбоксилазы, выделяющие CO ₂ в окружающую среду. Следовательно, эти фундаментальные реакции непосредственно участвуют в анаболизме, катаболизме и энергетическом метаболизме клетки и / или связывают их.В частности, узел фосфоенолпируват-пируват-оксалоацетат включает в себя специфичную для организма конфигурацию карбоксилирования (например, пируваткарбоксилазы (PCx), PEP-карбоксилазы, ацетил-CoA-карбоксилазы) и декарбоксилирования (например, PEP-карбоксикиназа; деруват-пирогенат-пируватогидрат яблочного фермента, оксарбоксилазогидрогенат декарбоксилазы, оксарбоксилазы) сложные реакции пируват: хинон оксидоредуктаза (рис. 4), которые имеют большое значение для распределения потока углерода в центральном метаболизме. Например, во время катаболизма сахара анаплеротический C3 (фосфоенолпируват (PEP) / пируват), карбоксилирование и декарбоксилирование пирувата до ацетил-CoA, по существу, необходимы для поддержания потока TCA, тогда как глюконеогенез зависит от декарбоксилирования C4 (оксалоацетат / малат) и декарбоксилирования Eikns (Sauer 2005). .Другим примером является пируватдекарбоксилаза дрожжей, которая является ключевым ферментом в ферментации этанола и по существу требуется для поддержания сбалансированного метаболизма в минеральных средах, содержащих глюкозу в качестве единственного источника углерода (Pronk et al., 1996).

Фигура 4. Пример, схематический обзор центрального метаболизма C. glutamicum , включая карбоксилазы и TPP-зависимые декарбоксилазы . Сокращения: АСС, ацетил-КоА карбоксилаза; AHAIR, изомероредуктаза ацетогидроксикислот; AHAS, синтаза ацетогидроксикислот; АК, ацетаткиназа; AlaT, аланинаминотрансфераза; AvtA, валин-пируватаминотрансфераза; CA, карбоангидраза; DHAD, дегидратаза дигидроксикислот; GDH, глутаматдегидрогеназа; GPDH, глюкозо-6P дегидрогеназа; ICD, изоцитратдегидрогеназа; MalE, яблочный фермент; ODHC, комплекс 2-кетоглутаратдегидрогеназы; ODx, оксалоацетатдекарбоксилаза; PCx, пируваткарбоксилаза; PDHC, пируватдегидрогеназный комплекс; Фосфоенолпируват ПЭП; PEPCk, PEP карбоксикиназа; PEPCx, карбоксилаза PEP; PGDH, 6P-глюконатдегидрогеназа; ПК, пируваткиназа; PQO, пируват: хинон оксидоредуктаза; ФТА, фосфотрансацетилаза; ТА, трансаминаза В; TPP, пирофосфат тиамина.

Карбоксилазы, катализирующие термодинамически дорогостоящую ассимиляцию CO2 / HCO3–, были классифицированы по их физиологической функции на автотрофные, ассимиляционные, биосинтетические, анаплеротические и окислительно-восстановительные ферменты (Erb, 2011). В настоящее время идентифицировано шесть путей фиксации CO ₂ : восстановительный пентозофосфатный цикл (Кальвин – Бенсон), восстановительный путь ацетил-КоА (Вуда – Люнгдаля), восстановительный цикл лимонной кислоты, 3-гидроксипропионатный цикл, дикарбоксилат / 4-гидроксибутиратный цикл и 3-гидроксипропионат / 4-гидроксибутиратный цикл (Erb, 2011; Fuchs, 2011).Кроме того, для увеличения скорости фиксации углерода были предложены новые синтетические пути (Bar-Even et al., 2010). Растения, водоросли и фототрофные прокариоты обладают рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазой / оксигеназой (RubisCO), количественно наиболее распространенным ферментом в биосфере и ключевым ферментом в автотрофной фиксации CO ₂ циклом Кальвина-Бенсона (Miziorko and Lorimer, 1983; Хартман, Харпель, 1994; Эрб, 2011). Примечательно, что путь Вуда – Люнгдаля является единственным, который фиксирует CO ₂ и одновременно генерирует АТФ путем преобразования ацетил-КоА в ацетат (Fuchs, 2011), что делает этот путь привлекательным и многообещающим для целей микробного производства на основе CO ₂ (Дюрре и Эйкманнс, 2015).

Благодаря ключевым метаболическим функциям, которые выполняют карбоксилазы и декарбоксилазы, соответствующие микробные ферменты, ферменты млекопитающих и растений были биохимически охарактеризованы, а их регуляция проанализирована [например, Miziorko and Lorimer (1983), Chollet et al. (1996), Hanson and Reshef (1997), Nikolau et al. (2003), Sauer and Eikmanns (2005) и Jitrapakdee et al. (2006)]. Связанная с CO2 / HCO3 аллостерическая регуляция и биохимические свойства соответствующих ферментов были проанализированы в некоторой степени (Jones and Greenfield, 1982), однако наше понимание пока еще ограничено.Промышленно важный грамположительный продукт C. glutamicum обладает биотин-зависимым PCx и PEP-карбоксилазой, обе с константами Михаэлиса-Ментен ( K _M ) для HCO3- около 3 мМ (Hanke et al., 2005 ; Chen et al., 2013), что примерно в 30 раз выше по сравнению с K _M (0,1 мМ, т.е. 4,4 мг / л) PEP-карбоксилазы из Escherichia coli в качестве единственного анаплеротического фермента (Kai et al. ., 1999). Эти различия уже указывают на то, что аэрация, специфичная для организма, необходима для обеспечения надлежащей метаболической активности путем поддержания достаточной доступности CO2 / HCO3- в начале ферментации, когда концентрации биомассы все еще низкие (Repaske et al., 1974; Talley and Baugh, 1975) или для продуктов, требующих высокого анаплеротического потока (например, сукцинат, l-лизин и производные продукты).

Благодаря диффузионному потенциалу CO ₂ и довольно медленному химическому превращению CO ₂ в HCO3- (Kern, 1960) природа независимо развила три класса (обозначенные как α, β и γ) цинка- зависимые угольные ангидразы (CA), которые катализируют с очень высокими числами оборота (до 10 ⁶ с ^-1 ) обратимую гидратацию CO ₂ (Рисунок 4; Tashian, 1989; Tripp et al., 2001). CA широко распространены во всех царствах жизни и играют жизненно важную роль в различных клеточных функциях, таких как фотосинтез, перенос ионов и гомеостаз pH (Smith and Ferry, 2000; Merlin et al., 2003; Mitsuhashi et al., 2004). По сути, КА поддерживают адекватные уровни HCO3- для аэробного роста в обычных атмосферных условиях, поскольку инактивация КА у некоторых организмов, таких как C. glutamicum, E. coli, Ralstonia eutropha, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae и Aspergillus nidulans , вызывает летальный, если только содержание CO ₂ в атмосфере не будет значительно увеличено (около 5–10%; Mitsuhashi et al., 2004; Мерлин и др., 2003; Кусиан и др., 2002; Götz et al., 1999; Cottier et al., 2012).

У млекопитающих митохондриальное дыхание генерирует CO ₂ как продукт жизнедеятельности, который должен активно переноситься кровью из тканей в легкие, удаляющие загрязнения. Так как HCO3- в отличие от CO ₂ непроницаем, клетки млекопитающих снабжены примерно 13 генами, кодирующими различные типы переносчиков бикарбоната, обеспечивающие межклеточный обмен прежних видов (Casey, 2006).Напротив, транспорт HCO3- у прокариот до сих пор наблюдался редко, за исключением хорошо изученной системы транспорта бикарбоната цианобактерий Synechococcus sp . штамм PCC7942. Два различных транспортных механизма для HCO3- поддерживают с комбинированным действием CA повышенные уровни CO ₂ в карбоксисомах, необходимые для эффективной фиксации углерода с помощью RubisCO (Ritchie et al., 1996; Badger and Price, 2003).

CO

CO ₂ является конечным респираторным продуктом и, следовательно, неизбежен в биопроцессах аэробных микробов и млекопитающих.В потоках выхлопных газов доля CO ₂ может возрасти до 15–20% в зависимости от аэрации и активности клеток. Учитывая, что избыточное давление при микробной ферментации обычно составляет 0,5–2 бар, а высота заполнения биореактора 10–15 м создает гидростатическое давление 1–1,5 бар, p _CO2 может достичь максимальных значений 0,1–0,6 бар на дне биореактора. Примечательно, что эти максимальные значения могут быть уменьшены, если там правильно установлена ​​вентиляция свежим воздухом. В принципе, сценарий аналогичен для культур млекопитающих, хотя и снижен из-за снижения активности клеток и меньшего размера биореактора по сравнению с микробными применениями (p _CO2 при производстве млекопитающих: около 0.180 бар _CO2 ; Чжу и др., 2005). Примечательно, что клетки, циркулирующие в крупномасштабных биореакторах, испытывают частые изменения уровней p _CO2 , факт, который обычно не моделируется с помощью псевдостационарных тестов уменьшения масштаба.

Было проведено множество исследований для выяснения влияния уровней p _CO2 на жизнедеятельность микробов (Dixon and Kell, 1989) и млекопитающих [например, Gray et al. (1996)]. Было проанализировано влияние на рост, выход биомассы на субстрат, образование продукта, деление клеток и морфологию.Они были связаны либо только с повышенным парциальным давлением CO ₂ , либо в сочетании с такими побочными эффектами, как изменение осмоляльности в среде. Наблюдаемые фенотипы индивидуальны. Тем не менее, ниже приведены некоторые характерные примеры, выделяющие основную кинетику промышленно интересных штаммов:

Бактерии

Первые признаки того, что бактерии действительно реагируют на повышенные уровни растворенного CO ₂ , были опубликованы Джонсом и Гринфилдом (1982).Среди прочего, они наблюдали, что рост Bacillus subtilis подавлялся на 40% при p _CO2 = 0,17 атм (0,172 бар). Пакетные исследования с использованием E. coli с использованием обогащенной CO ₂ аэрации показали, что максимальная скорость роста была сильно снижена, а выход биомассы на глюкозу увеличился для фракций аэрации> 20% диоксида углерода (Castan et al., 2002). Baez et al. (2009) изучали GFP, продуцирующий E. coli при постоянном p _CO2 в диапазоне 20–300 мбар.Их результаты подтвердили предыдущие выводы, измеряя снижение максимальной скорости роста μ _max более чем на 30% и удвоение образования ацетата при p _CO2 = 300 мбар по сравнению с эталоном. Для C. glutamicum Knoll et al. (2005) исследовали скорость роста μ в биореакторах с избыточным давлением (давление напора 10 бар) во время роста на глюкозе. Они наблюдали μ> 0,3 л / ч при p _CO2 = 0,43 бар. Этот вывод был подтвержден последующими исследованиями l-лизина, продуцирующего C.glutamicum (Knoll et al., 2007). Кроме того, были выполнены турбидостатические непрерывные культивации с различными уровнями p _CO2 . Скорость роста 0,58 л / ч оказалась почти постоянной до 0,18 бар p _CO2 и неуклонно снижалась до 0,36 л / ч при 0,8 бар _CO2 (Bäumchen et al., 2007). В 2013 году Blombach et al. изучили эффективность роста C. glutamicum в периодических культурах. Хотя не было обнаружено значимого фенотипа роста, при установке pCO ₂ около 0.3 бара, низкие уровни менее 50 мбар. _CO2 выявил трехфазную двухуровневую кинетику роста C. glutamicum (Blombach et al., 2013). Недавно Lopes et al. (2014) рассмотрели некоторые микробные фенотипы, вызванные повышенным уровнем углекислого газа в биореакторах с избыточным давлением.

Дрожжи

Chen и Gutmains (1976) сообщили об ингибировании роста дрожжей при высоких парциальных давлениях CO ₂ . Они обнаружили «небольшое» торможение роста при использовании фракций аэрации CO ₂ в 40% и резкое снижение роста при использовании воздуха, обогащенного 50% CO ₂ .Позже Курияма и др. (1993) подчеркнули эти ранние открытия, утверждая, что деление клеток S. cerevisiae может быть затруднено при p _CO2 = 0,5 атм (0,51 бар). Курияма и др. (1993) использовали подходы хемостата для изучения воздействия p _CO2 . Они обнаружили, что повышенное значение p _CO2 совпадает с повышенным образованием этанола, что само по себе может ухудшить производительность процесса. S. cerevisiae может адаптироваться к гипербарическим условиям (10 бар) при условии, что для адаптации достаточно времени (Belo et al., 2003). CO ₂ парциальное давление 0,48 бар оказало незначительное влияние на жизнеспособность клеток. Это также наблюдалось Knoll et al. (2007). Однако, если парциальные давления увеличиваются дальше (0,6 бар), почкование клеток затрудняется (Coelho et al., 2004). Действительно, снижение роста на 25% было сообщено Aguilera et al. (2005), когда фракция аэрации CO ₂ была увеличена до 79% в аэробных культивациях. Однако рост в анаэробных условиях был гораздо меньше затронут, что указывает на то, что респираторный метаболизм, вероятно, будет больше подвержен влиянию при высоких уровнях pCO ₂ .Это явление было в центре внимания недавних исследований. Ричард и др. (2014) подчеркнули, что временные метаболические реакции запускаются сдвигами CO ₂ , например, характеризующимися промежуточным увеличением частоты дыхания и экскрецией этанола и ацетата.

Грибки

Подобно бактериям и дрожжам, ингибирование роста (и образования продукта) также наблюдалось для грибов, таких как Penicillium chrysogenum , уже при p _CO2 = 0,08 атм (Jones and Greenfield, 1982).Хо и Смит (1986) уточнили это раннее наблюдение, определив снижение темпов роста и образования пенициллина, используя для культивирования воздух, обогащенный 12,6% CO ₂ . Тем не менее, причины и последствия высоких уровней p _CO2 для роста и образования продуктов не могут быть однозначно определены. Скорее, они могут быть косвенными эффектами, в конечном итоге приводящими к изменениям морфологии (McIntyre and McNeil, 1998). Также Гиббс и др. (2000) указали на химическое взаимодействие высокого p _CO2 с предшественниками биосинтеза пенициллина, в конечном итоге ухудшающее характеристики P.chrysogenum . Тем не менее, при высоких уровнях p _CO2 (установленный после использования входящего газа, обогащенного 10–15%) наблюдалось усиление лазания и резкое снижение выработки пенициллина (El-Sabbagh et al., 2006), не только для P. chrysogenum . но также для цефалоспорина С, продуцирующего Acremonium chrysogenum (El-Sabbagh et al., 2008).

Клетки млекопитающих (например, CHO)

Сегодня продуценты млекопитающих обычно происходят из тканевых клеток, придающих клеткам яичников китайского хомячка (СНО) исключительную важность для производства терапевтических белков (Pfizenmaier and Takors, 2015).Было подсчитано, что эти клетки испытывают уровни p _CO2 41–72 мбар в физиологических условиях (Altman and Dittmer, 1971). Однако условия промышленного производства, вероятно, будут требовать гораздо более высоких значений p _CO2 , особенно когда процессы находятся в центре внимания постоянной интенсификации (Ozturk, 1996). p _CO2 -индуцированный стресс обычно совпадает с увеличением осмоляльности из-за титрования для контроля pH. Следовательно, взаимодействие обоих эффектов часто находится на переднем плане соответствующих исследований.Кимура и Миллер (1996) проанализировали продукцию рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (tPA) клетками СНО. При максимальном p _CO2 333 мбар они наблюдали снижение скорости роста на 30%, которое увеличилось до снижения на 45% в сочетании с высокой осмоляльностью. Результаты Gray et al. (1996) предполагали, что оптимум для продукции рекомбинантного белка существует при 40–100 мбар p _CO2 . Zhu et al. (2005) показали, что промышленные условия осмоляльности (400–450 мОсм) вместе с типично высокими уровнями p _CO2 (180–213 март) вызывают 20% -ное падение жизнеспособности клеток СНО.Кроме того, Takuma et al. (2007) отметили, что промышленные значения p _CO2 , равные 293 мбар, снижали рост на 60%, в то время как специфическая для клеток продуктивность антител IgG1 практически не изменилась. Кроме того, были указания на то, что соответствующее ограничение глюкозы может компенсировать p _CO2 вызвало снижение роста при «умеренном» 190 мбар _CO2 .

Среди прочего, одна из причин ухудшения характеристик может заключаться в том, что характер гликозилирования белков снижается в присутствии повышенных уровней HCO3- (Zanghi et al., 1999). Кроме того, DeZengotita et al. (2002) утверждали, что гликолиз подавлялся дозозависимым образом, когда уровни p _CO2 были исследованы между 66 и 333 мбар в клетках гибридомы. Следовательно, ингибирование p _CO2 является не только вопросом только клеток СНО, но также наблюдается для культур гибридомы и HEK293S (Jardon and Garnier, 2003).

CO2 / HCO3 — Индуцированное регулирование

CO2 / HCO3- не только служит субстратом или продуктом для ферментов, но также влияет на внутренний pH, текучесть и проницаемость мембран, а также на физико-химические свойства белков и рассматривается как сигнал о вирулентности и выработке токсинов патогенами (Isenschmid et al. al., 1995; Стреттон и Гудман, 1998; Follonier et al., 2013). Из-за многократного участия CO2 / HCO3- в клеточном метаболизме кажется очевидным, что эти виды прямо или косвенно являются частью регуляторного аппарата.

Человеческое тело лежит в основе сложного гомеостаза CO2 / HCO3- с концентрациями бикарбоната до 140 мМ в определенных тканях (Arthurs and Sudhakar, 2005; Abuaita and Withey, 2009; Orlowski et al., 2013), что является ярким сигналом для патогенов, вторгающихся в организм. хозяин.Хотя прямая связь между CO ₂ и вирулентностью отсутствует, Park et al. (2011) обнаружили, что 10% CO ₂ стимулировал аэробный рост желудочного патогена человека Helicobacter pylori . Депривация CO ₂ привела к увеличению внутриклеточных уровней ppGpp, что может указывать на участие строгого ответа в CO ₂ -зависимой регуляции метаболизма H. pylori (Park et al., 2011). В Vibrio cholerae бикарбонат активирует регуляторный белок ToxT, который, в свою очередь, индуцирует экспрессию гена вирулентности (Abuaita and Withey, 2009).Другим регулятором транскрипции, воспринимающим бикарбонат, является AraC-подобный белок RegA из кишечного патогена мыши Citrobacter rodentium , который в присутствии бикарбоната активирует транскрипцию ряда генов вирулентности и подавляет экспрессию нескольких генов домашнего хозяйства (Yang et al., 2009 ). C. albicans грибковый патоген, вызывающий опасные для жизни инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, ощущает повышенные уровни HCO3- за счет растворимой аденилилциклазы (sAC) Cyr1p, которая продуцирует цАМФ.Затем цАМФ активирует протеинкиназу A, чтобы вызвать рост нитей, который является важным признаком адгезии и инвазии патогена (Klengel et al., 2005; Hall et al., 2010). Более того, фактор транскрипции Rca1p C. albicans , как было показано, контролирует экспрессию CA в ответ на доступность CO ₂ (Cottier et al., 2012). Оба примера демонстрируют важность системы передачи сигналов CO2 / HCO3- для глобальной регуляции метаболизма C. albicans .Регулирование с помощью растворимых AC, реагирующих на бикарбонат, по-видимому, более широко распространено во многих царствах, поскольку зависимая от CO2 / HCO3 регулировка внутриклеточного уровня цАМФ, первоначально обнаруженная в мужских половых клетках, также была идентифицирована у микобактерий, эубактерий, грибов и цианобактерий (Chen et al. al., 2000; Zippin et al., 2001; Bahn, Mühlschlegel, 2006).

Хотя при крупномасштабных ферментациях возникают градиенты растворенных газов и возникают высокие концентрации CO2 / HCO3- в зависимости от процесса и производственного хозяина (Hermann, 2003; Takors, 2012), лишь в нескольких исследованиях изучалось влияние измененных уровней этих веществ. о метаболизме и регуляции соответствующих промышленных микробных клеток систематически.Уже упомянутый анализ Baez et al. (2009) изучали влияние парциального давления 300 мбар на рекомбинантный GFP, продуцирующий E. coli , не только метаболически, но и на уровне транскрипции. Анализ экспрессии 16 выбранных генов выявил лишь незначительные изменения транскрипции. Примечательно, что в ответ на повышенное содержание растворенного CO ₂ транскрипция генов кислотного стресса ( gadA, gadC и adiA ) увеличивалась, что указывает на подкисление внутреннего pH за счет CO ₂ (Baez et al., 2009).

Недавно Follonier et al. (2013) подвергли Pseudomonas putida KT2440 воздействию повышенного давления (до 7 бар), связанного с повышенными концентрациями CO2 / HCO3- в биореакторе. Они исследовали глобальный транскрипционный ответ с помощью микрочипов ДНК. Физиология P. putida KT2440 практически не пострадала при повышенном давлении, однако наблюдались значительные изменения в транскрипции генов: повышенные уровни CO2 / HCO3- активировали реакцию теплового шока и сильно повлияли на экспрессию генов клеточной оболочки, что указывало на изменение проницаемости. / текучесть мембраны (Follonier et al., 2013).

Общегеномный транскрипционный ответ S. cerevisiae на высокие концентрации CO ₂ анализировали в культурах хемостата в аэробных и анаэробных условиях. В сочетании с более выраженной чувствительностью респираторного метаболизма высокие уровни CO ₂ в ограниченных по глюкозе культурах привели к 104, по крайней мере, двукратному изменению транскриптов по сравнению с 33 в анаэробных условиях. Интересно, что 50% затронутых транскриптов в аэробных условиях кодируют митохондриальные белки, такие как PEP-карбоксикиназа, PCx, и белки, участвующие в окислительном фосфорилировании (Aguilera et al., 2005).

Недавно мы исследовали влияние низких (pCO ₂ <40 мбар) и высоких (pCO ₂ ≥ 300 мбар) уровней CO2 / HCO3- на кинетику роста и транскрипционный ответ C. glutamicum по сравнению со стандартным условия. При высоких уровнях CO2 / HCO3- кинетика роста не изменилась, хотя соотношение биомассы к субстрату увеличилось. Однако наблюдали сложный транскрипционный ответ с участием 117 дифференциально экспрессируемых генов. Среди них 60 генов были отнесены к полному регулону DtxR / RipA, контролирующему гомеостаз железа у C.glutamicum . Мутант C. glutamicum Δ dtxR показал значительное нарушение роста в условиях высокого содержания CO2 / HCO3- (по сравнению с диким типом), но не в стандартных условиях. Это открытие подчеркивает важность главного регулятора для приспособленности клеток при высоких уровнях CO2 / HCO3- (Blombach et al., 2013). При низких уровнях CO2 / HCO3– C. glutamicum продемонстрировал три отдельные фазы роста. В средней фазе самого медленного роста C. glutamicum секретировал в среду l-аланин и l-валин и показал примерно в два раза более высокую активность глюкозо-6-P дегидрогеназы и 6-фосфоглконатдегидрогеназы и сильный транскрипционный ответ ( > 100 генов с измененной экспрессией), включая повышенную транскрипцию почти всех генов тиаминпирофосфата (TPP) по сравнению со стандартными условиями.Мы предположили, что C. glutamicum противодействует недостатку CO2 / HCO3-, запуская биосинтез TPP для увеличения активности TPP-зависимых ферментов, участвующих в образовании CO ₂ (Рисунок 4; Blombach et al., 2013).

Ячейки промышленного масштаба подвергаются воздействию различных градиентов, таких как pH, субстрат и растворенные газы. Для анализа влияния колебания уровней CO2 / HCO3- на метаболизм и транскрипционный ответ C. glutamicum была разработана новая трехкомпонентная каскадная биореакторная система.pCO ₂ градиентов 75–315 мбар при значительном для отрасли времени пребывания около 3,6 мин не оказали значительного влияния на кинетику роста, но привели к 66 дифференциально экспрессируемым генам по сравнению с контрольными условиями. Интересно, что общее изменение экспрессии было напрямую связано с градиентами pCO ₂ и временем пребывания клеток в устройстве для уменьшения масштаба (Buchholz et al., 2014b).

CO2 / HCO3- влияет на производственные процессы

Производственные процессы на гликолитических субстратах основаны на анаплеротической функции PCx и / или PEP карбоксилазы для пополнения промежуточных звеньев цикла лимонной кислоты, которые включены для анаболических требований и / или образования продукта.В частности, продукты на основе оксалоацетата, такие как l-лизин, требуют высокого анаплеротического потока. C. glutamicum — это рабочая лошадка в промышленном производстве l-лизина, обладающая PCx и PEP карбоксилазой. Несколько исследований идентифицировали PCx и особенно дерегулированные варианты как наиболее подходящие для улучшения поступления оксалоацетата, поскольку инактивация PCx снижала, а сверхэкспрессия соответствующего гена pyc значительно улучшала образование l-лизина у C. glutamicum (Peters-Wendisch et al., 2001; Ohnishi et al., 2002). Кроме того, инактивация PEP-карбоксикиназы привела к увеличению продукции l-лизина с помощью C. glutamicum (Riedel et al., 2001). Удивительно, хотя были предприняты большие усилия для адаптации пути биосинтеза и оптимизации доступности прекурсоров (Blombach and Seibold, 2010), влияние измененных уровней CO2 / HCO3- на аэробную продукцию l-лизина до сих пор систематически не исследовалось.

Очевидно, слишком низкие уровни CO2 / HCO3- могут ограничивать активность in vivo анаплеротических реакций.Сочетание высокой аэрации и низкой концентрации биомассы в начале ферментации, вероятно, вызовет задержку роста клеток из-за чрезмерного удаления CO ₂ . По аналогии, установка неограничивающих уровней CO2 / HCO3- особенно важна для биопроцессов нулевого роста или покоя клеток. Примерами являются синтез органических кислот, таких как малат, фумарат и сукцинат, которые образуются анаэробно из оксалоацетата через восстановительное звено цикла лимонной кислоты. В таких условиях метаболизм клетки обеспечивает лишь незначительное количество CO2 / HCO3–.Однако повышенная продуктивность может быть достигнута путем барботирования CO ₂ или добавления карбонатов в среду для обеспечения достаточного количества HCO3- для C3-карбоксилирования (Inui et al., 2004; Okino et al., 2005, 2008; Lu et al. , 2009; Zelle et al., 2010; Zhang et al., 2010; Wieschalka et al., 2012). Inui et al. (2004) и Okino et al. (2005) показали, что добавление NaHCO ₃ к среде значительно улучшило скорость потребления глюкозы и скорость продукции сукцината с покоящимися клетками C.glutamicum R. Radoš et al. (2014) продемонстрировали, что барботирование анаэробной культуры нерастущих C. glutamicum CO ₂ улучшает выход сукцината и ацетата, соответственно, за счет продукции лактата. ¹³ C Ядерно-магнитный резонансный анализ паттернов мечения в конечных продуктах подтвердил включение бикарбоната и образование сукцината, главным образом, через восстановительное звено цикла лимонной кислоты (Radoš et al., 2014). Для двухфазного (аэробный рост, анаэробное производство) процесса производства сукцината с рекомбинантным E.coli , было также показано, что увеличение содержания CO ₂ в газовой фазе с 0 до 50% значительно улучшает удельную производительность биомассы и выход сукцината (Lu et al., 2009). Чтобы обеспечить дополнительный CO ₂ и восстановительные эквиваленты для анаэробного производства сукцината из глюкозы, Litsanov et al. (2012) интегрировали ген fdh , кодирующий формиатдегидрогеназу из Mycobacterium vaccae , в хромосому сконструированного C.glutamicum штамм. Добавление формиата увеличивало выход сукцината на 20% в основном за счет увеличения доступности НАДН. Однако часть образовавшегося CO ₂ была включена в продукт (Litsanov et al., 2012).

Нехватка нефтяных ресурсов и постоянно растущие цены на нефть стимулировали усилия по производству химикатов и топлива непосредственно из CO ₂ . Производство этанола, изобутиральдегида и изобутанола из CO ₂ и света было достигнуто с использованием сконструированных фотосинтетических бактерий, таких как Rhodobacter capsulatus и Synechococcus elongates PCC7942 (Wahlund et al., 1996; Ацуми и др., 2009). Ли и др. (2012) показали возможность электрохимической подачи электронов для производства изобутанола и 3-метил-1-бутанола из CO ₂ с помощью сконструированного R. eutropha h26. Однако низкая производительность и конечный титр таких подходов и конструкции реактора по-прежнему остаются проблемой для будущего промышленного применения. Альтернативно, RubisCO был функционально экспрессирован в гетеротрофном S. cerevisiae , чтобы включить CO ₂ в качестве вспомогательного субстрата, улучшая выработку этанола и уменьшая образование побочного продукта глицерина в культурах хемостата (Guadalupe-Medina et al., 2013). Инновационный подход заключается в использовании CO ₂ и водородсодержащих отходящих газов или синтез-газа в качестве сырья для производства химикатов и топлива с ацетогенными и карбоксидотрофными бактериями. Процессы аэробной и анаэробной газовой ферментации были использованы из-за их биотехнологического потенциала, и коммерческие предприятия по производству этанола уже строятся (Dürre and Eikmanns, 2015).

Клетки-продуценты млекопитающих происходят от грызунов (таких как мышь или хомяк) или тканей человека.В случае, если они используются в погруженной культуре, они претерпели (иногда) утомительный переход на урожай в суспендированных клеточных линиях-продуцентах. Имея в виду эту историю, можно понять, почему образование продуктов в клетках-продуцентах, таких как CHO, часто оказывается сильно несвязанным с ростом (Altamirano et al., 2001). Этот факт даже используется подходами с понижением температуры (от 37 до ~ 30 ° C) для остановки клеток в фазе G1, в конечном итоге увеличивая производство клеточно-специфического белка. По аналогии, увеличение осмоляльности приводит к сходным фенотипам роста и образования продуктов (Ozturk and Palsson, 1991; Kumar et al., 2007). Как указано в предыдущих разделах, повышенная среда pCO ₂ > 100 мбар, вероятно, ингибирует рост клеток для культур СНО. Следовательно, на кинетику образования терапевтического белка (типичного) несвязанного типа роста вряд ли повлияет среда с высоким pCO ₂ . Действительно, результаты Takuma et al. (2007) поддерживают этот вывод. В случае, если наблюдается образование продукта, связанного с ростом, влияние повышенных парциальных давлений диоксида углерода может быть более выраженным.Это также верно для предполагаемых взаимодействий высоких уровней CO2 / HCO3- с клеточной мембраной или белками-продуктами. Однако для изучения этих индивидуальных эффектов необходимы дополнительные исследования.

Заключение

Подводя итог воздействиям высоких уровней CO2 / HCO3–, можно сказать, что снижение клеточного роста является типичным явлением. Хотя эффекты очень индивидуальны, чувствительность к высоким парциальным давлениям CO ₂ у бактерий менее выражена, чем у грибов или клеток-продуцентов млекопитающих.Как показывает опыт, pCO ₂ > 100 мбар отмечает начало торможения роста для более позднего периода.

С другой стороны, слишком низкие уровни CO2 / HCO3– могут ограничивать анаплеротические реакции внутри клеток. Следовательно, последующие предшественники, такие как оксалоацетат, могут стать ограничивающими, что влияет не только на рост клеток, но и на биосинтез связанных продуктов метаболизма.

В целом, транскрипционные ответы на высокий (или низкий) CO2 / HCO3- изучены гораздо меньше, чем метаболические фенотипы.Однако (возможно) удивительные регуляторные механизмы ждут своего открытия. Наглядным примером является случай C. glutamicum , который направлен на противодействие ограничению CO2 / HCO3- путем усиления биосинтеза TPP, известного как важный кофактор декарбоксилирующих ферментов. Высокие уровни CO2 / HCO3-, по-видимому, служат важным стимулом для некоторых патогенных микробов, чтобы идентифицировать хозяина и запускать соответствующие программы инвазии. В какой степени фрагменты или производные таких регуляторных сценариев также присутствуют в других клетках, также еще предстоит выяснить.

При использовании микробов, дрожжей, грибов и клеток млекопитающих в промышленных биореакторах необходимо учитывать некоторые особенности. Высокие уровни CO2 / HCO3- не влияют на клетки как единичное, изолированное событие. Они скорее происходят в сочетании с изменениями осмоляльности и pH, которые многократно стимулируют клетки. Однозначное определение причин и последствий может быть затруднено по сути. Для выяснения деталей воздействия CO2 / HCO3– необходим комплексный сетевой анализ.Примерами являются связь между CO2 / HCO3- и продуктивностью с изменениями морфологии грибов или осмоляльностью CHO. С другой стороны, равные уровни pCO ₂ могут служить ценным критерием увеличения масштаба, поскольку они отражают сложное взаимодействие клеточной активности, перемешивания и массопереноса (Klinger et al., 2015). Кроме того, следует учитывать, что стимулы CO2 / HCO3– возникают динамически в условиях промышленной эксплуатации. Клетки циркулируют в промышленных реакторах, поэтому уровни растворенного CO ₂ часто меняются.Следовательно, всесторонние испытания на масштабирование должны отражать эти условия, чтобы гарантировать, что перспективные новые производители будут одинаково хорошо работать в больших масштабах — как они должны.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы с благодарностью подтверждают финансирование этой работы Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), грант TA 241 / 5-1 и TA 241 / 5-2.Эта работа также была поддержана DFG в рамках программы финансирования Open Access Publishing.

Список литературы

Абуайта, Б. Х., и Уити, Дж. Х. (2009). Бикарбонат индуцирует экспрессию гена вирулентности Vibrio cholerae за счет усиления активности ToxT. Заражение. Иммун. 77, 4111–4120. DOI: 10.1128 / IAI.00409-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Агилера Дж., Пети Т., Де Винде Дж. Х. и Пронк Дж.Т. (2005). Физиологические и полногеномные транскрипционные ответы Saccharomyces cerevisiae на высокие концентрации диоксида углерода. FEMS Yeast Res. 5, 579–593. DOI: 10.1016 / j.femsyr.2004.09.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альтамирано, К., Каир, Дж. Дж., И Годия, Ф. (2001). Разделение роста клеток и образования продуктов в клетках яичников китайского хомячка посредством метаболического контроля. Biotechnol. Bioeng. 76, 351–360. DOI: 10.1002 / бит.10096

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альтман П. Л. и Диттмер Д. С. (ред.) (1971). Биологические справочники: дыхание и кровообращение. Bethesda: Федерация американских обществ экспериментальной биологии.

Google Scholar

Артурс Г. и Судхакар М. (2005). Транспорт углекислого газа. Продолж. Educ. Анаэст. Крит. Care Pain 5, 207–210.DOI: 10.1093 / bjaceaccp / mki050

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барсук, М. Р. и Прайс, Г. Д. (2003). CO ₂ механизмы концентрации в цианобактериях: молекулярные компоненты, их разнообразие и эволюция. J. Exp. Бот. 54, 609–622. DOI: 10.1093 / jxb / erg076

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баез А., Флорес Н., Боливар Ф. и Рамирес О. Т. (2009). Метаболический и транскрипционный ответ рекомбинантной Escherichia coli на повышенные концентрации растворенного диоксида углерода. Biotechnol. Bioeng. 104, 102–110. DOI: 10.1002 / bit.22379

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейли Дж. Э. и Оллис Д. Ф. (1986). Основы биохимической инженерии. 2 ^nd Edition, McGraw-Hill Chemical Engineering Series . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Макгроу-Хилл.

Google Scholar

Баллестра П., Да Силва А. А. и Кук Дж. Л. (1996). Инактивация Escherichia coli углекислым газом под давлением. J. Food Sci. 61, 829–831. DOI: 10.1111 / j.1365-2621.1996.tb12212.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бар-Эвен А., Нур Э., Льюис Н. Э. и Майло Р. (2010). Дизайн и анализ синтетических путей фиксации углерода. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 8889–8894. DOI: 10.1073 / pnas.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bäumchen, C., Knoll, A., Husemann, B., Селецкий, Дж., Майер, Б., Дитрих, К. и др. (2007). Влияние повышенных концентраций растворенного диоксида углерода на рост Corynebacterium glutamicum на D-глюкозе и L-лактате. J. Biotechnol. 128, 868–874. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2007.01.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бломбах Б., Бухгольц Дж., Буше Т., Калиновски Дж. И Такорс Р. (2013). Влияние различных уровней CO ₂ / HCO ₃ ^— на метаболизм и регуляцию у Corynebacterium glutamicum . J. Biotechnol. 168, 331–340. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2013.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бломбах Б. и Зайболд Г. М. (2010). Углеводный обмен в Corynebacterium glutamicum и приложения для метаболической инженерии штаммов, продуцирующих L-лизин. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 86, 1313–1322. DOI: 10.1007 / s00253-010-2537-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ботун, Г.Д., Кнутсон, Б. Л., Берберих, Дж. А., Штробель, Х. Дж., И Нокс, С. Е. (2004). Метаболическая селективность и рост Clostridium thermocellum в непрерывной культуре при повышенном гидростатическом давлении. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 65, 149–157. DOI: 10.1007 / s00253-004-1554-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бухгольц, Дж., Граф, М., Бломбах, Б., и Такорс, Р. (2014a). Улучшение углеродного баланса ферментации путем анализа общего углерода. Biochem. Англ. J. 90, 162–169. DOI: 10.1016 / j.bej.2014.06.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Buchholz, J., Graf, M., Freund, A., Busche, T., Kalinowski, J., Blombach, B., et al. (2014b). CO ₂ / HCO ₃ ^— возмущения смоделированных крупномасштабных градиентов в устройстве для уменьшения масштаба вызывают быстрые транскрипционные ответы у Corynebacterium glutamicum . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 98, 8563–8572.DOI: 10.1007 / s00253-014-6014-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кастан А., Нэсман А. и Энфорс С.-О. (2002). Подача воздуха, обогащенного кислородом, в процессах Escherichia coli : производство биомассы и рекомбинантного гормона роста человека. Enzyme Microb. Technol. 30, 847–854. DOI: 10.1016 / S0141-0229 (01) 00490-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, Ю., Канн, М.Дж., Литвин, Т. Н., Юргенко, В., Синклер, М. Л., Левин, Л. Р. и др. (2000). Растворимая аденилатциклаза как эволюционно консервативный сенсор бикарбоната. Наука 289, 625–628. DOI: 10.1126 / science.289.5479.625

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, З., Боммаредди, Р. Р., Франк, Д., Рэпперт, С., и Цзэн, А.-П. (2013). Отмена регуляции ингибирования фосфоенолпируваткарбоксилазы по обратной связи для улучшения продукции лизина в Corynebacterium glutamicum . Заявл. Environ. Microbiol. 80, 1388–1393. DOI: 10.1128 / AEM.03535-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чолле Р., Видаль Дж. И О’Лири М. Х. (1996). Пируваткарбоксилаза: широко распространенный высоко регулируемый фермент в растениях. Annu. Rev. Plant Physiol. Завод Мол. Биол. 47, 273–298. DOI: 10.1146 / annurev.arplant.47.1.273

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коэльо, М.А. З., Белу И., Пинейро Р., Амарал А. Л., Мота М., Коутиньо Дж. А. П. и др. (2004). Влияние гипербарического стресса на морфологию дрожжей: исследование с помощью автоматического анализа изображений. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 66, 318–324. DOI: 10.1007 / s00253-004-1648-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cottier, F., Raymond, M., Kurzai, O., Bolstad, M., Leewattanapasuk, W., Jiménez-López, C., et al. (2012). Фактор транскрипции bZIP Rca1p является центральным регулятором нового пути восприятия CO ₂ у дрожжей. PLoS Pathog. 8: e1002485. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1002485

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Danckwerts, П. В. (1951). Значение коэффициентов жидкой пленки при абсорбции газа. Ind. Eng. Chem. 43, 1460–1467. DOI: 10.1021 / ie50498a055

CrossRef Полный текст | Google Scholar

ДеЗенготита В. М., Шмельцер А. Э. и Миллер В. М. (2002). Характеристика ответов гибридомных клеток на повышенный pCO ₂ и осмоляльность: внутриклеточный pH, размер клеток, апоптоз и метаболизм. Biotechnol. Bioeng. 77, 369–380. DOI: 10.1002 / бит.10176

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Диксон, Н. М., и Келл, Д. Б. (1989). Подавление CO ₂ роста и метаболизма микроорганизмов. J. Appl. Бактериол. 67, 109–136. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.1989.tb03387.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дюрре П., Эйкманнс Б. Дж. (2015). Источники углерода C1 для химического и топливного производства путем микробной газовой ферментации. Curr. Opin. Biotechnol. 35, 63–72. DOI: 10.1016 / j.copbio.2015.03.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эль-Саббаг, Н., Харви, Л. М., и МакНил, Б. (2008). Влияние растворенного диоксида углерода на рост, потребление питательных веществ, синтез цефалоспорина С и морфологию Acremonium chrysogenum в периодических культурах. Enzyme Microb. Technol. 42, 315–324. DOI: 10.1016 / j.enzmictec.2007.10.012

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эль-Саббаг, Н., Макнил Б. и Харви Л. М. (2006). Влияние растворенного диоксида углерода на рост, потребление питательных веществ, синтез и морфологию пенициллина в периодических культурах Penicillium chrysogenum . Enzyme Microb. Technol. 39, 185–190. DOI: 10.1016 / j.enzmictec.2005.10.020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фоллонье С., Эскапа И. Ф., Фонсека П. М., Хенес Б., Панке С., Зинн М. и др. (2013). Новые сведения о реорганизации транскрипции гена в Pseudomonas putida KT2440 при повышенном давлении. Microb. Cell Fact. 12, 30. DOI: 10.1186 / 1475-2859-12-30

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фукс, Г. (2011). Альтернативные пути фиксации углекислого газа: понимание ранней эволюции жизни? Annu. Rev. Microbiol. 65, 631–658. DOI: 10.1146 / annurev-micro-0-102801

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсия-Гонсалес, Л., Гирард, А. Х., Спилимберго, С., Элст, К., Ван Гиннекен, Л., Дебевере, Дж. И др. (2007). Инактивация микроорганизмов в пищевых продуктах углекислым газом под высоким давлением: прошлое, настоящее и будущее. Внутр. J. Food Microbiol. 117, 1–28. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2007.02.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гиббс П. А., Севиур Р. Дж. И Шмид Ф. (2000). Рост нитчатых грибов в погруженной культуре: проблемы и возможные решения. Crit. Rev. Biotechnol. 20, 17–48. DOI: 10.1080 / 073885500177

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гётц Р., Гнанн А. и Циммерманн Ф. К. (1999). Делеция карбоангидразоподобного гена NCE103 дрожжей Saccharomyces cerevisiae вызывает чувствительный к кислороду дефект роста. Дрожжи 15, 855–864. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0061 (199907) 15: 10A <855: AID-YEA425> 3.0.CO; 2-C

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грей, Д.Р., Чен, С., Ховарт, В., Инлоу, Д., и Майорелла, Б. Л. (1996). CO ₂ в крупномасштабной и высокоплотной перфузионной культуре клеток CHO. Цитотехнология 22, 65–78. DOI: 10.1007 / BF00353925

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Guadalupe-Medina, V., Wisselink, H. W., Luttik, M. A., de Hulster, E., Daran, J.-M., Pronk, J. T., et al. (2013). Фиксация углекислого газа ферментами цикла Кальвина улучшает выход этанола в дрожжах. Biotechnol. Биотопливо 6, 125. doi: 10.1186 / 1754-6834-6-125

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гуткнехт, Дж., Биссон, М. А., и Тостесон, Ф. К. (1977). Диффузия диоксида углерода через двухслойные липидные мембраны: эффекты карбоангидразы, бикарбоната и неперемешиваемых слоев. J. Gen. Physiol. 69, 779–794. DOI: 10.1085 / jgp.69.6.779

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холл, р.A., de Sordi, L., MacCallum, D. M., Topal, H., Eaton, R., Bloor, J. W., et al. (2010). CO ₂ действует как сигнальная молекула в популяциях грибкового патогена Candida albicans . PLoS Pathog. 6: e1001193. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1001193

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ханке, П. Д., Сински, А. Дж., И Уиллис, Л. Б. (2005). Ген резистентной к обратной связи пируваткарбоксилазы из Corynebacterium .Патент США № 6965021.

Google Scholar

Хартман, Ф. К., и Харпель, М. Р. (1994). Структура, функция, регуляция и сборка D-рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы. Annu. Rev. Biochem. 63, 197–234. DOI: 10.1146 / annurev.bi.63.070194.001213

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хигби Р. (1935). Скорость абсорбции чистого газа неподвижной жидкостью в течение коротких периодов воздействия. Пер. Являюсь. Inst. Chem. Англ. 31, 364–389.

Google Scholar

Хо, С. С. и Смит, М. Д. (1986). Влияние растворенного углекислого газа на ферментацию пенициллина: рост мицелия и производство пенициллина. Biotechnol. Bioeng. 28, 668–677. DOI: 10.1002 / бит. 260280506

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Инуи, М., Мураками, С., Окино, С., Кавагути, Х., Вертес, А.А., Юкава, Х.(2004). Метаболический анализ Corynebacterium glutamicum во время производства лактата и сукцината в условиях кислородной недостаточности. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7, 182–196. DOI: 10.1159 / 000079827

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Изеншмид А., Марисон И. В. и фон Стокар У. (1995). Влияние давления и температуры сжатого CO ₂ на выживаемость дрожжевых клеток. Дж.Biotechnol. 39, 229–237. DOI: 10.1016 / 0168-1656 (95) 00018-L

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джитрапакди С., Видал-Пуч А. и Уоллес Дж. К. (2006). Анаплеротическая роль пируваткарбоксилазы в тканях млекопитающих. Cell. Мол. Life Sci. 63, 843–854. DOI: 10.1007 / s00018-005-5410-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонс, Р. П., и Гринфилд, П. Ф. (1982). Влияние углекислого газа на рост и брожение дрожжей. Enzyme Microb. Technol. 4, 210–223. DOI: 10.1016 / 0141-0229 (82)

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кай Ю., Мацумура Х., Иноуэ Т., Терада К., Нагара Ю., Йошинага Т. и др. (1999). Трехмерная структура фосфоенолпируваткарбоксилазы: предложенный механизм аллостерического ингибирования. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96, 823–828. DOI: 10.1073 / pnas.96.3.823

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кимура, Р., и Миллер, В. М. (1996). Влияние повышенного pCO ₂ и / или осмоляльности на рост и продукцию рекомбинантного tPA клеток СНО. Biotechnol. Bioeng. 52, 152–160. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0290 (19961005) 52: 1 <152: AID-BIT15> 3.0.CO; 2-квартал

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Klengel, T., Liang, W. J., Chaloupka, J., Ruoff, C., Schröppel, K., Naglik, J. R., et al. (2005). Аденилилциклаза грибов интегрирует зондирование CO ₂ с передачей сигналов цАМФ и вирулентностью. Curr. Биол. 15, 2021–2026. DOI: 10.1016 / j.cub.2005.10.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клингер К., Шмидбергер К. и Эйзенкраетцер Д. (2015). Стратегии уменьшения масштабов процессов клеточных культур. Устная презентация на конференции DECHEMA, Увеличение и уменьшение масштаба биопроцессов . Гамбург.

Google Scholar

Knoll, A., Bartsch, S., Husemann, B., Engel, P., Schroer, K., Ribeiro, B., et al. (2007). Выращивание рекомбинантных дрожжей и бактерий с высокой плотностью клеток в условиях отсутствия давления и повышенного давления в биореакторах с мешалкой. J. Biotechnol. 132, 167–179. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2007.06.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кнолль, А., Майер, Б., Черриг, Х., и Бюкс, Дж. (2005). Кислородный массоперенос, ингибирование углекислого газа, отвод тепла, а также энергетическая и экономическая эффективность ферментации под высоким давлением. Adv. Biochem. Англ. Biotechnol. 92, 77–99. DOI: 10.1007 / b98918

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кумар, Н., Гаммелл, П., и Клайнс, М. (2007). Стратегии контроля пролиферации для повышения продуктивности и выживаемости во время производственной культуры на основе СНО: краткое изложение использованных в последнее время методов и эффектов контроля пролиферации в продуктах, секретирующих клеточные линии СНО. Цитотехнология 53, 33–46. DOI: 10.1007 / s10616-007-9047-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Курияма, Х., Махакарнчанакул, В., Мацуи, С., и Кобаяши, Х. (1993). Влияние pCO ₂ на рост и метаболизм дрожжей при непрерывной ферментации. Biotechnol. Lett. 15, 189–194. DOI: 10.1007 / BF00133022

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кусиан Б., Сюльтемейер Д. и Боуэн Б. (2002). Карбоангидраза необходима для роста Ralstonia eutropha при концентрациях CO ₂ в окружающей среде. J. Bacteriol. 184, 5018–5026. DOI: 10.1128 / JB.184.18.5018-5026.2002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х., Опдженорт, П. Х., Верник, Д. Г., Роджерс, С., Ву, Т.-Й., Хигашид, В. и др. (2012). Интегрированное электромикробное преобразование CO ₂ в высшие спирты. Наука 335, 1596. DOI: 10.1126 / science.1217643

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лицанов, Б., Брокер М., Ботт М. (2012). На пути к гомосукцинатной ферментации: метаболическая инженерия Corynebacterium glutamicum для получения анаэробного сукцината из глюкозы и формиата. Заявл. Environ. Microbiol. 78, 3325–3337. DOI: 10.1128 / AEM.07790-11

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лу С., Эйтман М. А. и Альтман Э. (2009). Влияние CO ₂ на продукцию сукцината при двухфазной ферментации Escherichia coli . J. Biotechnol. 143, 213–223. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2009.07.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Макинтайр, М., и Макнил, Б. (1998). Морфогенетические и биохимические эффекты растворенного углекислого газа на мицелиальных грибах при глубинном культивировании. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 50, 291–298. DOI: 10.1007 / s002530051293

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мерлин, К., Мастерс, М., Макэтир, С., и Колсон, А. (2003). Почему карбоангидраза необходима для Escherichia coli ? J. Bacteriol. 185, 6415–6424. DOI: 10.1128 / JB.185.21.6415-6424.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мицухаси, С., Охниши, Дж., Хаяси, М., Икеда, М. (2004). Ген, гомологичный карбоангидразе бета-типа, необходим для роста Corynebacterium glutamicum в атмосферных условиях. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 63, 592–601. DOI: 10.1007 / s00253-003-1402-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мизиорко, Х. М., и Лоример, Г. Х. (1983). Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза-оксигеназа. Annu. Rev. Biochem. 52, 507–532. DOI: 10.1146 / annurev.bi.52.070183.002451

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Noorman, H.J., Luijkx, G.C.A., Luyben, K.C., and Heijnen, J.Дж. (1992). Моделирование и экспериментальное подтверждение выделения углекислого газа в алкалофильных культурах. Biotechnol. Bioeng. 39, 1069–1079. DOI: 10.1002 / бит.2603

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ohnishi, J., Mitsuhashi, S., Hayashi, M., Ando, ​​S., Yokoi, H., Ochiai, K., et al. (2002). Новая методология, использующая информацию генома Corynebacterium glutamicum для создания нового мутанта, продуцирующего L-лизин. Заявл.Microbiol. Biotechnol. 58, 217–223. DOI: 10.1007 / s00253-001-0883-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Окино, С., Инуи, М., Юкава, Х. (2005). Продукция органических кислот Corynebacterium glutamicum при кислородном голодании. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 68, 475–480. DOI: 10.1007 / s00253-005-1900-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Окино, С., Нобурю, Р., Суда, М., Дзёдзима, Т., Инуи, М., и Юкава, Х. (2008). Эффективный процесс производства янтарной кислоты в метаболически модифицированном штамме Corynebacterium glutamicum . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 81, 459–464. DOI: 10.1007 / s00253-008-1668-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Орловски А., Варгас Л. А., Айелло А. и Альварес Б. В. (2013). Повышенный уровень диоксида углерода активирует NBCn1 Na ⁺ / HCO ₃ ^— котранспортер в эмбриональных клетках почек человека. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F1765 – F1774. DOI: 10.1152 / ajprenal.00096.2013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Озтурк, С.С., Палссон, Б.О. (1991). Влияние осмолярности среды на рост, метаболизм и выработку антител гибридомы. Biotechnol. Bioeng. 37, 989–993. DOI: 10.1002 / бит. 260371015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Парк, С. А., Ко, А., и Ли, Н.Г. (2011). Стимуляция роста патогена желудка человека Helicobacter pylori атмосферным уровнем кислорода при высоком давлении углекислого газа. BMC Microbiol. 11:96. DOI: 10.1186 / 1471-2180-11-96

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петерс-Вендиш, П. Г., Шиль, Б., Вендиш, В. Ф., Кацулидис, Э., Мёкель, Б., Сам, Х. и др. (2001). Пируваткарбоксилаза является основным узким местом для производства глутамата и лизина Corynebacterium glutamicum . J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 295–300.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Пфизенмайер Дж. И Такорс Р. (2015). «Клетка млекопитающего-хозяина», в Industrial Biotechnology , ред. К. Виттманн и Дж. Ляо (Weinheim: Wiley-VCH Verlag).

Google Scholar

Pronk, J. T., Yde Steensma, H., and Van Dijken, J. P. (1996). Метаболизм пирувата в Saccharomyces cerevisiae . Дрожжи 12, 1607–1633.DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0061 (199612) 12:16 <1607: AID-YEA70> 3.0.CO; 2-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Радош, Д. X. I., Тернер, Д. Л., Фонсека, Л. Л., Карвалью, А. Л., Бломбах, Б., Эйкманнс, Б. и др. (2014). Влияние CO ₂ на продукцию анаэробного сукцината Corynebacterium glutamicum : анализ потока углерода с помощью 13С-ЯМР. Заявл. Environ. Microbiol. 80, 3015–3024. DOI: 10.1128 / AEM.04189-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Репаске, Р., Repaske, A.C., и Mayer, R.D. (1974). Контроль углекислого газа за период задержки и рост Streptococcus sanguis . J. Bacteriol. 117, 652–659.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Ричард, Л., Гийэ, С. Э., и Урибеларреа, Ж.-Л. (2014). Количественная оценка временной и долговременной реакции Saccharomyces cerevisiae на стресс углекислого газа различной интенсивности. Process Biochem. 49, 1808–1818.DOI: 10.1016 / j.procbio.2014.07.020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Riedel, C., Rittmann, D., Dangel, P., Möckel, B., Petersen, S., Sahm, H., et al. (2001). Характеристика гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы из Corynebacterium glutamicum и значение фермента для роста и продукции аминокислот. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 573–583.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Ричи Р.Дж., Надольный К., Ларкум А. (1996). Движущие силы для транспорта бикарбоната в цианобактерии Synechococcus R-2 (PCC 7942). Plant Physiol. 112, 1573–1584.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Зауэр, У., и Эйкманнс, Б. Дж. (2005). Узел ПЭП-пируват-оксалоацетат как точка переключения для распределения потока углерода в бактериях. FEMS Microbiol. Rev. 29, 765–794. DOI: 10.1016 / j.femsre.2004.11.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сеченов, М.(1889 г.). Über die Konstitution der Salzlösungen auf Grund ihres Verhaltens zu Kohlensäure. Z. Phys. Chem. 4, 117–125.

Google Scholar

Штумм В. и Морган Дж. Дж. (1995). Химия водной среды: химическое равновесие и скорость в природных водах , 3-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Wiley.

Google Scholar

Такума С., Хирасима К. и Пирет Дж. М. (2007). Зависимость от ограничения глюкозы pCO ₂ влияет на рост клеток CHO, метаболизм и продукцию IgG. Biotechnol. Bioeng. 97, 1479–1488. DOI: 10.1002 / бит.21376

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Талли Р. С. и Боуг К. Л. (1975). Влияние бикарбоната на рост Neisseria gonorrhoeae : замена газообразного CO ₂ атмосферой. Заявл. Microbiol. 29, 469–471.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Трипп, Б. К., Смит, К., и Ферри, Дж. Г.(2001). Карбоангидраза: новые открытия для древнего фермента. J. Biol. Chem. 276, 48615–48618. DOI: 10.1074 / jbc.R100045200

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валунд, Т. М., Конвей, Т., и Табита, Ф. Р. (1996). Биоконверсия CO ₂ в этанол и другие соединения. ACS Div. Fuel Chem. Преп. 41, 1403–1405.

Google Scholar

Вишалка, С., Бломбах, Б., Ботт, М., и Эйкманнс, Б.J. (2012). Производство органических кислот на биологической основе с использованием Corynebacterium glutamicum . Microb. Biotechnol. 6, 87–102. DOI: 10.1111 / 1751-7915.12013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг Дж., Договски К., Хокинг Д., Таушек М., Перуджини М. и Робинс-Браун Р. М. (2009). Опосредованная бикарбонатом стимуляция RegA, глобального регулятора вирулентности из Citrobacter rodentium . J. Mol. Биол. 394, 591–599. DOI: 10.1016 / j.jmb.2009.10.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Занги, Дж. А., Шмельцер, А. Э., Мендоза, Т. П., Кноп, Р. Х. и Миллер, В. М. (1999). Концентрация бикарбоната и осмоляльность являются ключевыми детерминантами в ингибировании полисиалирования клеток CHO при повышенном pCO ₂ или pH. Biotechnol. Bioeng. 65, 182–191. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0290 (199

) 65: 2 <182: AID-BIT8> 3.0.CO; 2-D

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зелле, Р.М., де Хульстер, Э., Клезен, В., Пронк, Дж. Т., и ван Марис, А. Дж. А. (2010). Ключевые условия процесса производства дикарбоновых кислот C ₄ в биореакторных культурах сконструированного штамма Saccharomyces cerevisiae . Заявл. Environ. Microbiol. 76, 744–750. DOI: 10.1128 / AEM.02396-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, X., Ван, X., Шанмугам, К. Т., и Инграм, Л. О. (2010). Производство L-малата с помощью метаболической инженерии Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 77, 427–434. DOI: 10.1128 / AEM.01971-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу М. М., Гоял А., Ранк Д. Л., Гупта С. К., Ванден Бум Т. и Ли С. С. (2005). Влияние повышенного pCO ₂ и осмоляльности на рост клеток CHO и выработку слитого с антителом белка B1: тематическое исследование. Biotechnol. Прог. 21, 70–77. DOI: 10.1021 / bp049815s

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зиппин, Дж.Х., Левин Л. Р. и Бак Дж. (2001). CO ₂ / HCO ₃ ^— чувствительная растворимая аденилатциклаза в качестве предполагаемого метаболического сенсора. Trends Endocrinol. Метаб. 12, 366–370. DOI: 10.1016 / S1043-2760 (01) 00454-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

CO2 — внутренний продукт, необходимый субстрат и регуляторный триггер производственных процессов микробов и млекопитающих

Front Bioeng Biotechnol. 2015; 3: 108.

Бастиан Бломбах

¹ Институт биохимической инженерии, Штутгартский университет, Штутгарт, Германия

Ральф Такорс

¹ Институт биохимической инженерии, Штутгартский университет, Штутгартский институт

, Штутгарт, Германия

Отредактировал: Хилал Таймаз Никерел, Университет Богазичи, Турция

Рецензировал: Аншу Бхардвадж, Совет научных и промышленных исследований, Индия; Петер Нойбауэр, Технический университет Берлина, Германия; Антонино Баез, Автономный университет Пуэбла, Мексика

Специальный раздел: эта статья была отправлена ​​в раздел «Системная биология» журнала «Границы биоинженерии и биотехнологии»

Поступила в редакцию 22 мая 2015 г .; Принято 13 июля 2015 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY). Использование, распространение или воспроизведение на других форумах разрешено при условии указания автора (авторов) или лицензиара и ссылки на оригинальную публикацию в этом журнале в соответствии с принятой академической практикой.Запрещается использование, распространение или воспроизведение без соблюдения этих условий.

Abstract

Образование диоксида углерода отражает заключительные стадии окисления углерода в аэробном метаболизме в клетках микробов и млекопитающих. Как следствие, в ферментерах растущей культурой возникает равновесие диссоциации CO2 / HCO3-. Анаплеротические реакции используют обильные уровни CO2 / HCO3- для пополнения потребностей цикла лимонной кислоты и для получения продуктов, полученных из оксалоацетата.В то же время CO ₂ многократно высвобождается в метаболических реакциях за счет активности декарбоксилирования. Уровни внеклеточного CO2 / HCO3- зависят от клеточной активности и физических ограничений, таких как гидростатическое давление, аэрация и эффективность перемешивания в крупномасштабных биореакторах. Кроме того, локальные уровни CO2 / HCO3- могут также действовать как метаболические ингибиторы или эффекторы транскрипции, запускающие регуляторные события внутри клеток. В этом обзоре дается обзор фундаментальных физико-химических свойств CO2 / HCO3- в культурах микробов и млекопитающих, влияющих на клеточную физиологию, производственные процессы, метаболическую активность и регуляцию транскрипции.

Ключевые слова: бикарбонат, диоксид углерода, производственный процесс, регулирование, карбоксилирование, декарбоксилирование

Введение

Одно из наиболее решающих решений, которое необходимо принять при разработке новых биопроцессов, — будет ли конечный процесс протекать в анаэробных или аэробных условиях. условия. В то время как значительно сниженные инвестиционные затраты говорят в пользу анаэробного производства, ожидаемая производительность и доступность внутриклеточной энергии являются движущими силами для аэробных подходов.Анаэробный метаболизм дает два чистых АТФ, образующихся при гликолизе, на глюкозу, в то время как аэробные аналоги могут достигать> 12 АТФ. Этот чистый выход АТФ даже представляет собой консервативную оценку с учетом истинного отношения АТФ к кислороду (P / O) 1: 1,3, что ниже теоретических максимумов 2–3. Следовательно, аэробные процессы часто являются первым выбором, если нацелено на образование продукта, вызывающего АТФ, с максимальной скоростью образования специфичных для клеток.

Двуокись углерода (CO ₂ ) является неизбежным продуктом процессов дыхания и поэтому всегда присутствует в аэробных биопроцессах.Это также верно для производства товаров, тонких химикатов или терапевтических белков с использованием микробов или клеток млекопитающих. В то время как терапевтические белки и химические вещества тонкой очистки обычно производятся в биореакторах размером 5–20 м ³ , производство товаров обычно осуществляется размером 50–500 м ³ или даже больше. Как внутреннее свойство, парциальные давления CO ₂ этих весов значительно отличаются от тех, которые обнаруживаются в лабораторных масштабах. Это явление является неотъемлемым следствием высокого абсолютного давления и плохих условий перемешивания в крупномасштабных биореакторах (Takors, 2012).

CO ₂ и его гидратированный аналог HCO3- могут не только служить субстратом или продуктом для реакций карбоксилирования и декарбоксилирования, эти виды могут также изменять физико-химические свойства белков, подкислять внутренний pH и регулировать вирулентность и выработку токсинов патогенами ( Follonier et al., 2013). Следовательно, CO2 / HCO3- может взаимодействовать с клеточным метаболизмом и даже создавать сложные транскрипционные ответы. CO ₂ не только свободно диффундирует через клеточную мембрану (Gutknecht et al., 1977), он также может накапливаться в том же самом (Jones and Greenfield, 1982; Kuriyama et al., 1993; Bothun et al., 2004), тем самым увеличивая его проницаемость и текучесть, что в конечном итоге приводит к потенциально смертельному «эффекту анестезии». (Isenschmid et al., 1995).

Тот факт, что высокие уровни pCO ₂ используются для стерилизации пищевых продуктов (Ballestra et al., 1996; Spilimbergo and Bertucco, 2003; Garcia-Gonzalez et al., 2007), предполагает, что повышенные уровни pCO ₂ вряд ли будут улучшить производительность процессов производства микробов или млекопитающих.Вместо этого, как будет показано ниже, высокие уровни pCO ₂ часто совпадают с ухудшением характеристик биопроцесса. Следовательно, при тщательных масштабных исследованиях желательно учитывать анализ воздействий pCO ₂ , чтобы гарантировать одинаково хорошие результаты в крупномасштабном масштабе по сравнению с ожиданиями лабораторного масштаба. Это особенно верно для создания новых биопроцессов, которые являются результатом исследований системной метаболической инженерии, проводимых в лабораторных условиях.

Целью данной статьи является обзор фундаментальных свойств, источников и воздействия CO ₂ на производственные процессы микробов и млекопитающих.Он сводится к объединению основных частей головоломки о том, как CO2 / HCO3– взаимодействует с клетками-продуцентами. Это покажет, что многое уже сделано, но еще не все до конца понятно. Это особенно верно для регуляции клеточного метаболизма, где CO2 / HCO3-, по-видимому, до сих пор является недооцененным триггером.

Основы — Физико-химические свойства и массоперенос

Двуокись углерода (CO ₂ , молярная масса: 44,01 г / моль) представляет собой бесцветный газ линейной молекулярной формы без запаха с температурой плавления -56.6 ° С. Он присутствует в атмосфере Земли в виде микропримесей, в настоящее время его уровень составляет около 400 ppm с тенденцией к неуклонному увеличению (http://co2now.org/).

Растворимость в воде можно описать с помощью закона Генри.

HCO2 = cCO2, LpCO2 [ммоль л бар]

(1)

с c _{CO2, L} и p _CO2 , кодирующими равновесные значения молярной концентрации растворенного CO ₂ в жидкости L и соответствующее парциальное давление CO ₂ соответственно.Для чистой воды при 25 ° C приводится коэффициент Генри H _CO2 = 34,5 ммоль / барл (Stumm and Morgan, 1995). Использование корреляции Ван’т-Гоффа

dlnHCO2dT = ΔH0RT2⇒HCO2 (T) = lnK − ΔH0RT

(2)

Температурная зависимость константы равновесия (здесь: коэффициент Генри H _CO2 ) может быть оценена с помощью стандартного изменения энтальпии реакции Δ H ⁰ , универсальной газовой постоянной R и абсолютной температура T как показано.Примечательно, что K кодирует постоянную интегрирования, которая может быть получена из справочных данных, например, при 25 ° C. Используя уравнение (2), можно рассчитать H _CO2 ( T = 20 ° C) = 40 ммоль / барл и H _CO2 ( T = 37 ° C) = 25 ммоль / барл. . Уменьшение коэффициентов Генри [как определено в (1)] отражает уменьшение растворимости газа при повышении температуры — типичное явление для растворенных газов в данном диапазоне температур.

Помимо температуры, на растворимость CO ₂ также влияет концентрация электролита.Следуя эмпирическому подходу Сеченова (1889), можно учитывать отдельные вклады ионной силы для оценки итоговой растворимости газа в солесодержащей жидкости (Noorman et al., 1992). Однако состав ферментационной среды часто бывает сложным и постоянно меняется в процессе культивирования. Причинами являются образование продуктов и побочных продуктов, расход субстрата и добавление титрующих агентов. Поэтому наиболее практичным подходом является измерение растворимости CO ₂ в реальных средах для культивирования.Собственные экспериментальные наблюдения показывают, что реальные значения H _CO2 [согласно (1)] часто увеличиваются, могут даже удваиваться, по сравнению со значениями для чистой воды (неопубликованные данные).

При обычных условиях эксплуатации при культивировании микробов или млекопитающих выделяются выхлопные газы с объемной долей CO ₂ 5–25%. Для консервативной оценки можно предположить условия равновесия между газом и жидкостью со значениями H _CO2 для чистой воды при 37 ° C.Затем растворенный CO ₂ уровней c _{CO2, L} , вероятно, будет находиться в диапазоне от 75 до 375 мг / л. Например, Blombach et al. (2013) измерили уровень p _CO2 около 160 мбар (около 360 мг / л) в конце аэрированного (0,1 объемного объема) 1,5 бар периодического культивирования с перемешиванием с 5 г _CDW Corynebacterium glutamicum на л. Увеличение аэрации до 3 vvm снизило p _CO2 до 40 мбар (около 90 мг / л). Подобные значения наблюдались Buchholz et al.(2014b). Напротив, максимальная концентрация растворенного кислорода в атмосферных условиях обычно составляет 7,5–8 мг / л (опять же, в зависимости от состава среды). Следовательно, уровни растворенного CO ₂ намного превосходят уровни растворенного O ₂ . Этот вывод может быть еще более очевидным, если принять во внимание характеристики массопереноса (рисунок).

Принципы переноса CO ₂ . CO ₂ выделяется клетками и переносится через окружающую жидкую пленку посредством диффузии.После выхода из этого слоя толщиной в несколько мкм растворенный CO ₂ попадает в зону хорошо перемешанного вещества и переносится к пузырькам посредством конвекции. Чтобы достичь пузырьков, растворенный CO ₂ должен снова пройти через окружающую пленку путем диффузии. Зонды для измерения растворенного CO ₂ или O ₂ устанавливаются в конвективной зоне, что дает соответствующий сигнал.

Рисунок показывает, что максимальные уровни c _{CO2, L} обнаруживаются в ближайшем микроокружении клеток.По тренду датчики для измерения растворенного газа обнаруживают более низкие уровни. Это отличается от растворенного кислорода, где клетки сталкиваются с самыми низкими уровнями на пути массопереноса.

Хотя уровни растворенного диоксида углерода могут достигать высоких значений ингибирования во время процесса ферментации, вместо этого начальные условия могут быть ограничивающими. При условии наличия равновесия между входящей аэрацией и жидкостью 0,5 мг _CO2 / л. Примечательно, что это низкое значение, вероятно, сохранится, если слишком высокая аэрация (с низкой концентрацией CO ₂ ) удаляет новый метаболически продуцируемый CO ₂ .Следовательно, анаплеротические реакции могут быть ограничены подачей субстрата (HCO3- / CO2) (см. Раздел «Метаболическое высвобождение и включение»), что в конечном итоге приведет к снижению роста клеток.

По аналогии с переносом кислорода, скорость переноса CO ₂ CTR (ммоль / лч) можно описать следующим образом:

CTR = kLaCO2 (cCO2, L * −cCO2, L)

(3)

с k _L a _CO2 кодировка для CO ₂ коэффициент массопереноса (1 / час), cCO2, L * для растворенного CO ₂ концентрация в состоянии равновесия в соответствии с законом Генри (ммоль / л) ) и c _{CO2, л} , представляющий измеренную концентрацию (ммоль / л).

Истинное измерение k _L a _{Значения CO2} на практике довольно сложно. Один из подходов состоит в том, чтобы принять CTR = CER , т. Е. Интенсивность выбросов диоксида углерода CER равна CO ₂ степени очистки CTR . Путем уравновешивания потоков аэрации и выхлопных газов должны быть доступны соответствующие значения, и соответственно можно получить k _L a _CO2 . Тем не менее этот подход обнаруживает свой недостаток, когда культуры клеток млекопитающих сбалансированы.Здесь сигнал выхлопных газов представляет собой суперпозицию биологической активности и добавления CO ₂ для титрования. В качестве альтернативы, k _L a _CO2 может быть оценено из k _L a _O2 согласно следующему:

Уравнение (4) является результатом теории проникновения Хигби Хигби (1935) и модели возобновляемой поверхности Данквертса Данквертса (1951). По-видимому, коэффициент массопереноса для CO ₂ пропорционален отношению коэффициентов диффузии D для CO ₂ и O ₂ в воде.Поскольку значения k _L a _O2 относительно легко измерить, этот подход предлагает прямой доступ к k _L a _CO2 . Однако перенос CO ₂ принципиально отличается от переноса O ₂ , поскольку были учтены характеристики диссоциации (см. Рисунок).

Равновесие диссоциации CO ₂ разновидностей в зависимости от pH . Константы равновесия K ₁ = 10 ^{−6.Было выбрано 3} M и K ₂ = 10 ^−10,25 M. Подробности см. В тексте.

CO ₂ диссоциирует в воде в зависимости от pH следующим образом:

CO2 + h3O↔k − 1 k1h3CO3↔fastHCO3- + H + ↔fastCO32- + 2H +

(5)

Поскольку равновесие диссоциации CO ₂ находится далеко на стороне ангидрида (99,8%), концентрации угольной кислоты H ₂ CO ₃ являются низкими, не превышающими однозначные микромолярные диапазоны при типичных условиях культивирования.Следовательно, кажущаяся константа равновесия K ₁ (Bailey and Ollis, 1986):

K1 = [H +] [HCO3 -] [CO2] + [h3CO3] ≅ [H +] [HCO3 -] [CO2] = 10−6,3M

(6)

сформулирована и дополнена Бейли и Оллисом (1986) следующим образом:

K2 = [H +] [CO32 -] [HCO3 -] = 10−10.25M

(7)

Можно с уверенностью предположить, что реакции (детонирования) протонирования формулы (5) протекают очень быстро. Однако предполагается, что образование и диссоциация угольной кислоты из CO ₂ ограничивают общий процесс уравновешивания. k ₁ и k ₋₁ были оценены как 0,03 1 / с и 20 1 / с, соответственно (Bailey and Ollis, 1986).

При типичных условиях культивирования (pH 7) 83,3% видов CO ₂ присутствуют в виде HCO3- и только 16,7% в виде CO ₂ . Следовательно, концентрация HCO3- примерно в пять раз выше, чем концентрация CO ₂ . Это утверждение справедливо не только для среды культивирования, но и для внутриклеточных условий, поскольку клетки стремятся поддерживать свой внутриклеточный pH примерно на этом уровне.

Рисунок подтверждает, что полное рассмотрение отдельных видов CO ₂ , HCO3- и CO32- имеет решающее значение для получения точных значений общего CO ₂ c _T , растворенного в ферментационной суспензии. Недавно Buchholz et al. (2014a) отметили, что игнорирование анионов приводит к углеродному разрыву около 20% в течение первых часов ферментации. Примечательно, что уровень растворенного CO ₂ не зависит от pH (см. Рисунок). Согласно закону Генри только парциальное давление (и солевые условия) могут влиять на c _CO2 .Следовательно, крупномасштабные биореакторы, которые имеют высокое гидростатическое давление 1–1,5 бар, имеют более высокие уровни растворенного CO ₂ , чем сопоставимые лабораторные системы. Это не только вызывает регуляторные ответы в клетках, но также влияет на буферную способность крупномасштабной суспензии. Из-за повышенных уровней CO2 / HCO3- буферность pH значительно увеличивается в больших масштабах по сравнению с лабораторными ферментациями.

Распределение CO ₂ видов в воде при атмосферных условиях (25 ° C) .Приведены виды согласно формуле (5), а также их сумма c _T [рисунок изменен по Бейли и Оллис (1986)].

Метаболическое высвобождение и включение

Метаболизм всех живых организмов обеспечивается набором карбоксилаз, включающих CO ₂ или бикарбонат (HCO3-) в органические молекулы, и декарбоксилазы, выделяющие CO ₂ в окружающую среду. Следовательно, эти фундаментальные реакции непосредственно участвуют в анаболизме, катаболизме и энергетическом метаболизме клетки и / или связывают их.В частности, узел фосфоенолпируват-пируват-оксалоацетат включает в себя специфичную для организма конфигурацию карбоксилирования (например, пируваткарбоксилазы (PCx), PEP-карбоксилазы, ацетил-CoA-карбоксилазы) и декарбоксилирования (например, PEP-карбоксикиназа; деруват-пируват-пирогенат декарбоксилазы; яблочный фермент, оксарбоксилазогидрогенат, оксарбоксилазагидрогенат, оксарбоксил-гидрогенат, оксарбоксилаза). сложные реакции пируват: хинон оксидоредуктаза (рисунок), которые имеют большое значение для распределения потока углерода в центральном метаболизме. Например, во время катаболизма сахара анаплеротический C3 (фосфоенолпируват (PEP) / пируват), карбоксилирование и декарбоксилирование пирувата до ацетил-CoA, по существу, необходимы для поддержания потока TCA, тогда как глюконеогенез зависит от декарбоксилирования C4 (оксалоацетат / малат) и декарбоксилирования Eikns (Sauer 2005). .Другим примером является пируватдекарбоксилаза дрожжей, которая является ключевым ферментом в ферментации этанола и по существу требуется для поддержания сбалансированного метаболизма в минеральных средах, содержащих глюкозу в качестве единственного источника углерода (Pronk et al., 1996).

Пример, схематический обзор центрального метаболизма C. glutamicum , включая карбоксилазы и TPP-зависимые декарбоксилазы . Сокращения: АСС, ацетил-КоА карбоксилаза; AHAIR, изомероредуктаза ацетогидроксикислот; AHAS, синтаза ацетогидроксикислот; АК, ацетаткиназа; AlaT, аланинаминотрансфераза; AvtA, валин-пируватаминотрансфераза; CA, карбоангидраза; DHAD, дегидратаза дигидроксикислот; GDH, глутаматдегидрогеназа; GPDH, глюкозо-6P дегидрогеназа; ICD, изоцитратдегидрогеназа; MalE, яблочный фермент; ODHC, комплекс 2-кетоглутаратдегидрогеназы; ODx, оксалоацетатдекарбоксилаза; PCx, пируваткарбоксилаза; PDHC, пируватдегидрогеназный комплекс; Фосфоенолпируват ПЭП; PEPCk, PEP карбоксикиназа; PEPCx, карбоксилаза PEP; PGDH, 6P-глюконатдегидрогеназа; ПК, пируваткиназа; PQO, пируват: хинон оксидоредуктаза; ФТА, фосфотрансацетилаза; ТА, трансаминаза В; TPP, пирофосфат тиамина.

Карбоксилазы, катализирующие термодинамически дорогостоящую ассимиляцию CO2 / HCO3–, были классифицированы по их физиологической функции на автотрофные, ассимиляционные, биосинтетические, анаплеротические и окислительно-восстановительные ферменты (Erb, 2011). В настоящее время идентифицировано шесть путей фиксации CO ₂ : восстановительный пентозофосфатный цикл (Кальвин – Бенсон), восстановительный путь ацетил-КоА (Вуда – Люнгдаля), восстановительный цикл лимонной кислоты, 3-гидроксипропионатный цикл, дикарбоксилат / 4-гидроксибутиратный цикл и 3-гидроксипропионат / 4-гидроксибутиратный цикл (Erb, 2011; Fuchs, 2011).Кроме того, для увеличения скорости фиксации углерода были предложены новые синтетические пути (Bar-Even et al., 2010). Растения, водоросли и фототрофные прокариоты обладают рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазой / оксигеназой (RubisCO), количественно наиболее распространенным ферментом в биосфере и ключевым ферментом в автотрофной фиксации CO ₂ циклом Кальвина-Бенсона (Miziorko and Lorimer, 1983; Хартман, Харпель, 1994; Эрб, 2011). Примечательно, что путь Вуда – Люнгдаля является единственным, который фиксирует CO ₂ и одновременно генерирует АТФ путем преобразования ацетил-КоА в ацетат (Fuchs, 2011), что делает этот путь привлекательным и многообещающим для целей микробного производства на основе CO ₂ (Дюрре и Эйкманнс, 2015).

Благодаря ключевым метаболическим функциям, которые выполняют карбоксилазы и декарбоксилазы, соответствующие микробные ферменты, ферменты млекопитающих и растений были биохимически охарактеризованы, а их регуляция проанализирована [например, Miziorko and Lorimer (1983), Chollet et al. (1996), Hanson and Reshef (1997), Nikolau et al. (2003), Sauer and Eikmanns (2005) и Jitrapakdee et al. (2006)]. Связанная с CO2 / HCO3 аллостерическая регуляция и биохимические свойства соответствующих ферментов были проанализированы в некоторой степени (Jones and Greenfield, 1982), однако наше понимание пока еще ограничено.Промышленно важный грамположительный продукт C. glutamicum обладает биотин-зависимым PCx и PEP-карбоксилазой, обе с константами Михаэлиса-Ментен ( K _M ) для HCO3- около 3 мМ (Hanke et al., 2005 ; Chen et al., 2013), что примерно в 30 раз выше по сравнению с K _M (0,1 мМ, т.е. 4,4 мг / л) PEP-карбоксилазы из Escherichia coli в качестве единственного анаплеротического фермента (Kai et al. ., 1999). Эти различия уже указывают на то, что аэрация, специфичная для организма, необходима для обеспечения надлежащей метаболической активности путем поддержания достаточной доступности CO2 / HCO3- в начале ферментации, когда концентрации биомассы все еще низкие (Repaske et al., 1974; Talley and Baugh, 1975) или для продуктов, требующих высокого анаплеротического потока (например, сукцинат, l-лизин и производные продукты).

Из-за диффузионного потенциала CO ₂ и довольно медленного химического превращения CO ₂ в HCO3- (Kern, 1960) природа независимо развила три класса (обозначенные как α, β и γ) цинка. -зависимые угольные ангидразы (CA), которые катализируют с очень высокими числами оборота (до 10 ⁶ с ^-1 ) обратимую гидратацию CO ₂ (рисунок; Tashian, 1989; Tripp et al., 2001). CA широко распространены во всех царствах жизни и играют жизненно важную роль в различных клеточных функциях, таких как фотосинтез, перенос ионов и гомеостаз pH (Smith and Ferry, 2000; Merlin et al., 2003; Mitsuhashi et al., 2004). По сути, CA поддерживают адекватные уровни HCO3- для аэробного роста в обычных атмосферных условиях, поскольку инактивация CA у нескольких организмов, таких как C. glutamicum, E. coli, Ralstonia eutropha, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae и Aspergillus nidulans , является летальный, если только содержание CO ₂ в атмосфере не будет значительно увеличено (около 5–10%; Mitsuhashi et al., 2004; Мерлин и др., 2003; Кусиан и др., 2002; Götz et al., 1999; Cottier et al., 2012).

У млекопитающих митохондриальное дыхание генерирует CO ₂ как продукт жизнедеятельности, который должен активно переноситься кровью из тканей в легкие, очищающие от загрязнений. Так как HCO3- в отличие от CO ₂ непроницаем, клетки млекопитающих снабжены примерно 13 генами, кодирующими различные типы переносчиков бикарбоната, обеспечивающие межклеточный обмен прежних видов (Casey, 2006).Напротив, транспорт HCO3– у прокариот до сих пор наблюдался редко, за исключением хорошо изученной системы транспорта бикарбонатов цианобактерий Synechococcus sp . штамм PCC7942. Два различных транспортных механизма для HCO3- поддерживают с комбинированным действием CA повышенные уровни CO ₂ в карбоксисомах, необходимые для эффективной фиксации углерода с помощью RubisCO (Ritchie et al., 1996; Badger and Price, 2003).

CO

CO ₂ — конечный респираторный продукт и, следовательно, неизбежный в биопроцессах аэробных микробов и млекопитающих.В потоках выхлопных газов доля CO ₂ может возрасти до 15–20% в зависимости от аэрации и активности клеток. Учитывая, что избыточное давление при микробной ферментации обычно составляет 0,5–2 бар, а высота заполнения биореактора 10–15 м создает гидростатическое давление 1–1,5 бар, p _CO2 может достичь максимальных значений 0,1–0,6 бар на дне биореактора. Примечательно, что эти максимальные значения могут быть уменьшены, если там правильно установлена ​​вентиляция свежим воздухом. В принципе, сценарий аналогичен для культур млекопитающих, хотя и снижен из-за снижения активности клеток и меньшего размера биореактора по сравнению с микробными применениями (p _CO2 при производстве млекопитающих: около 0.180 бар _CO2 ; Чжу и др., 2005). Примечательно, что клетки, циркулирующие в крупномасштабных биореакторах, испытывают частые изменения уровней p _CO2 , факт, который обычно не моделируется с помощью псевдостационарных тестов уменьшения масштаба.

Было проведено множество исследований для выяснения влияния уровней p _CO2 на микробную (Dixon and Kell, 1989) и функцию млекопитающих [например, Gray et al. (1996)]. Было проанализировано влияние на рост, выход биомассы на субстрат, образование продукта, деление клеток и морфологию.Они были связаны либо только с повышенным парциальным давлением CO ₂ , либо в сочетании с такими побочными эффектами, как изменение осмоляльности в среде. Наблюдаемые фенотипы индивидуальны. Тем не менее, некоторые характерные примеры приведены ниже, выделяя основную кинетику промышленно интересных штаммов:

Бактерии

Первые признаки того, что бактерии действительно реагируют на повышенные уровни растворенного CO ₂ , были опубликованы Джонс и Гринфилд (1982). Среди прочего, они наблюдали, что рост Bacillus subtilis подавлялся на 40% при p _CO2 = 0.17 атм (0,172 бар). Пакетные исследования с E. coli с использованием аэрации, обогащенной CO ₂ , показали, что максимальная скорость роста была сильно снижена, а выход биомассы на глюкозу увеличился для фракций аэрации> 20% диоксида углерода (Castan et al., 2002). Baez et al. (2009) изучали GFP, продуцирующий E. coli при постоянном p _CO2 в диапазоне 20–300 мбар. Их результаты подтвердили предыдущие выводы, измеряя снижение максимальной скорости роста μ _max более чем на 30% и удвоение образования ацетата при p _CO2 = 300 мбар по сравнению с эталоном.Для C. glutamicum Knoll et al. (2005) исследовали скорость роста μ в биореакторах с избыточным давлением (давление напора 10 бар) во время роста на глюкозе. Они наблюдали μ> 0,3 л / ч при p _CO2 = 0,43 бар. Этот вывод был подтвержден последующими исследованиями штамма C. glutamicum , продуцирующего l-лизин (Knoll et al., 2007). Кроме того, были выполнены турбидостатические непрерывные культивации с различными уровнями p _CO2 . Скорость роста 0,58 л / ч оказалась практически постоянной до 0.18 бар p _CO2 и неуклонно снижается до 0,36 л / ч при давлении _CO2 0,8 бар (Bäumchen et al., 2007). В 2013 году Blombach et al. изучили эффективность роста C. glutamicum в периодических культурах. Хотя при установке pCO ₂ около 0,3 бар не было обнаружено значительного фенотипа роста, низкие уровни менее 50 мбар _CO2 выявили трехфазную двухуровневую кинетику роста C. glutamicum (Blombach et al., 2013) . Недавно Lopes et al. (2014) рассмотрели некоторые микробные фенотипы, вызванные повышенным уровнем углекислого газа в биореакторах с избыточным давлением.

Дрожжи

Chen и Gutmains (1976) сообщили об ингибировании роста дрожжей при высоких парциальных давлениях CO ₂ . Они обнаружили «небольшое» торможение роста при использовании фракций аэрации CO ₂ в 40% и резкое снижение роста при использовании воздуха, обогащенного 50% CO ₂ . Позже Курияма и др. (1993) подчеркнули эти ранние открытия, утверждая, что деление клеток S. cerevisiae может быть затруднено при p _CO2 = 0,5 атм (0,51 бар). Курияма и др.(1993) использовали подходы хемостата для изучения воздействия p _CO2 . Они обнаружили, что повышенное значение p _CO2 совпадает с повышенным образованием этанола, что само по себе может ухудшить производительность процесса. S. cerevisiae способен адаптироваться к гипербарическим условиям (10 бар) при условии, что им предоставлено достаточно времени для адаптации (Belo et al., 2003). CO ₂ парциальное давление 0,48 бар оказало незначительное влияние на жизнеспособность клеток. Это также наблюдалось Knoll et al. (2007).Однако, если парциальные давления увеличиваются дальше (0,6 бар), почкование клеток затрудняется (Coelho et al., 2004). Действительно, снижение роста на 25% было сообщено Aguilera et al. (2005), когда фракция аэрации CO ₂ была увеличена до 79% в аэробных культивациях. Однако рост в анаэробных условиях был гораздо меньше затронут, что указывает на то, что респираторный метаболизм, вероятно, будет больше подвержен влиянию при высоких уровнях pCO ₂ . Это явление было в центре внимания недавних исследований.Ричард и др. (2014) подчеркнули, что временные метаболические реакции запускаются сдвигами CO ₂ , например, характеризующимися промежуточным увеличением частоты дыхания и экскрецией этанола и ацетата.

Грибы

Подобно бактериям и дрожжам, ингибирование роста (и образования продуктов) также наблюдалось для грибов, таких как Penicillium chrysogenum , уже при p _CO2 = 0,08 атм (Jones and Greenfield, 1982). Хо и Смит (1986) уточнили это раннее наблюдение, определив снижение темпов роста и образования пенициллина с помощью 12.6% CO ₂ обогащенный воздух для выращивания. Тем не менее, причины и последствия высоких уровней p _CO2 для роста и образования продуктов не могут быть однозначно определены. Скорее, они могут быть косвенными эффектами, в конечном итоге приводящими к изменениям морфологии (McIntyre and McNeil, 1998). Также Гиббс и др. (2000) указали на химическое взаимодействие высокого p _CO2 с предшественниками биосинтеза пенициллина, в конечном итоге ухудшающее характеристики P. chrysogenum . Тем не менее, при высоких уровнях p _CO2 (установленный после использования входящего газа, обогащенного 10–15%) наблюдалось усиление лазания и резкое снижение выработки пенициллина (El-Sabbagh et al., 2006) не только для P. chrysogenum , но и для цефалоспорина C, продуцирующего Acremonium chrysogenum (El-Sabbagh et al., 2008).

Клетки млекопитающих (например, CHO)

Сегодня продуценты млекопитающих обычно происходят из тканевых клеток, что придает клеткам яичника китайского хомячка (СНО) исключительную важность для производства терапевтических белков (Pfizenmaier and Takors, 2015). Было подсчитано, что эти клетки испытывают уровни p _CO2 41–72 мбар в физиологических условиях (Altman and Dittmer, 1971).Однако условия промышленного производства, вероятно, будут требовать гораздо более высоких значений p _CO2 , особенно когда процессы находятся в центре внимания постоянной интенсификации (Ozturk, 1996). p _CO2 -индуцированный стресс обычно совпадает с увеличением осмоляльности из-за титрования для контроля pH. Следовательно, взаимодействие обоих эффектов часто находится на переднем плане соответствующих исследований. Кимура и Миллер (1996) проанализировали продукцию рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (tPA) клетками СНО. При максимальном p _CO2 333 мбар они наблюдали снижение скорости роста на 30%, которое увеличилось до снижения на 45% в сочетании с высокой осмоляльностью.Результаты Gray et al. (1996) предполагали, что оптимум для продукции рекомбинантного белка существует при 40–100 мбар p _CO2 . Zhu et al. (2005) показали, что промышленные условия осмоляльности (400–450 мОсм) вместе с типично высокими уровнями p _CO2 (180–213 март) вызывают 20% -ное падение жизнеспособности клеток СНО. Кроме того, Takuma et al. (2007) отметили, что промышленные значения p _CO2 , равные 293 мбар, снижали рост на 60%, в то время как специфическая для клеток продуктивность антител IgG1 практически не изменилась.Кроме того, были указания на то, что соответствующее ограничение глюкозы могло компенсировать p _CO2 вызвал снижение роста при «умеренном» 190 мбар _CO2 .

Среди прочего, одна из причин ухудшения характеристик может заключаться в том, что паттерны гликозилирования белков снижаются в присутствии повышенных уровней HCO3- (Zanghi et al., 1999). Кроме того, DeZengotita et al. (2002) утверждали, что гликолиз подавлялся дозозависимым образом, когда уровни p _CO2 были исследованы между 66 и 333 мбар в клетках гибридомы.Следовательно, ингибирование p _CO2 является не только вопросом только клеток СНО, но также наблюдается для культур гибридомы и HEK293S (Jardon and Garnier, 2003).

CO2 / HCO3 — Индуцированное регулирование

CO2 / HCO3 — не только служит субстратом или продуктом для ферментов, но также влияет на внутренний pH, текучесть и проницаемость мембран, а также на физико-химические свойства белков и рассматривается как сигнал для вирулентности и выработки токсинов патогенами (Isenschmid et al., 1995; Стреттон и Гудман, 1998; Follonier et al., 2013). Из-за многократного участия CO2 / HCO3- в клеточном метаболизме кажется очевидным, что эти виды прямо или косвенно являются частью регуляторного аппарата.

Человеческое тело лежит в основе сложного гомеостаза CO2 / HCO3- с концентрациями бикарбонатов до 140 мМ в определенных тканях (Arthurs and Sudhakar, 2005; Abuaita and Withey, 2009; Orlowski et al., 2013), что является ярким сигналом для вторжения патогенов. гостья.Хотя прямая связь между CO ₂ и вирулентностью отсутствует, Park et al. (2011) обнаружили, что 10% CO ₂ стимулировал аэробный рост желудочного патогена человека Helicobacter pylori . Депривация CO ₂ привела к увеличению внутриклеточных уровней ppGpp, что может указывать на участие строгого ответа в CO ₂ -зависимой регуляции метаболизма H. pylori (Park et al., 2011). В Vibrio cholerae бикарбонат активирует регуляторный белок ToxT, который, в свою очередь, индуцирует экспрессию гена вирулентности (Abuaita and Withey, 2009).Другой регулятор транскрипции, воспринимающий бикарбонат, — это AraC-подобный белок RegA из кишечного патогена мыши Citrobacter rodentium , который в присутствии бикарбоната активирует транскрипцию ряда генов вирулентности и подавляет экспрессию нескольких генов домашнего хозяйства (Yang et al., 2009 ). C. albicans грибковый патоген, вызывающий опасные для жизни инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, ощущает повышенные уровни HCO3- за счет растворимой аденилилциклазы (sAC) Cyr1p, которая продуцирует цАМФ.Затем цАМФ активирует протеинкиназу A, чтобы вызвать рост нитей, который является важным признаком адгезии и инвазии патогена (Klengel et al., 2005; Hall et al., 2010). Более того, фактор транскрипции Rca1p C. albicans , как было показано, контролирует экспрессию CA в ответ на доступность CO ₂ (Cottier et al., 2012). Оба примера демонстрируют важность системы передачи сигналов CO2 / HCO3- для глобальной регуляции метаболизма C. albicans .Регулирование с помощью растворимых AC, реагирующих на бикарбонат, по-видимому, более широко распространено во многих царствах, поскольку зависимая от CO2 / HCO3 регулировка внутриклеточного уровня цАМФ, первоначально обнаруженная в мужских половых клетках, также была идентифицирована у микобактерий, эубактерий, грибов и цианобактерий (Chen et al. al., 2000; Zippin et al., 2001; Bahn, Mühlschlegel, 2006).

Хотя при крупномасштабных ферментациях возникают градиенты растворенных газов и возникают высокие концентрации CO2 / HCO3- в зависимости от процесса и производственного хозяина (Hermann, 2003; Takors, 2012), лишь в нескольких исследованиях изучалось влияние измененных уровней этих газов. видов на метаболизм и регуляцию промышленных микробных клеток систематически.Уже упомянутый анализ Baez et al. (2009) изучали влияние парциального давления 300 мбар на рекомбинантный GFP, продуцирующий E. coli , не только на метаболическом, но и на транскрипционном уровне. Анализ экспрессии 16 выбранных генов выявил лишь незначительные изменения транскрипции. Примечательно, что в ответ на повышенное содержание растворенного CO ₂ транскрипция генов кислотного стресса ( gadA, gadC и adiA ) увеличивалась, что указывает на подкисление внутреннего pH CO ₂ (Baez et al., 2009).

Недавно Follonier et al. (2013) подвергли Pseudomonas putida KT2440 воздействию повышенного давления (до 7 бар), связанного с повышенными концентрациями CO2 / HCO3- в биореакторе. Они исследовали глобальный транскрипционный ответ с помощью микрочипов ДНК. Физиология P. putida KT2440 практически не пострадала при повышенном давлении, однако наблюдались значительные изменения в транскрипции генов: повышенные уровни CO2 / HCO3- активировали реакцию теплового шока и сильно повлияли на экспрессию генов клеточной оболочки, что указывало на изменение проницаемости. / текучесть мембраны (Follonier et al., 2013).

Транскрипционный ответ по всему геному S. cerevisiae на высокие концентрации CO ₂ анализировали в культурах хемостата в аэробных и анаэробных условиях. В сочетании с более выраженной чувствительностью респираторного метаболизма высокие уровни CO ₂ в ограниченных по глюкозе культурах привели к 104, по крайней мере, двукратному изменению транскриптов по сравнению с 33 в анаэробных условиях. Интересно, что 50% затронутых транскриптов в аэробных условиях кодируют митохондриальные белки, такие как PEP-карбоксикиназа, PCx, и белки, участвующие в окислительном фосфорилировании (Aguilera et al., 2005).

Недавно мы исследовали влияние низких (pCO ₂ <40 мбар) и высоких (pCO ₂ ≥ 300 мбар) уровней CO2 / HCO3- на кинетику роста и транскрипционный ответ C. glutamicum по сравнению с стандартные условия. При высоких уровнях CO2 / HCO3- кинетика роста не изменилась, хотя соотношение биомассы к субстрату увеличилось. Однако наблюдали сложный транскрипционный ответ с участием 117 дифференциально экспрессируемых генов. Среди них 60 генов были отнесены к полному регулону DtxR / RipA, контролирующему гомеостаз железа у C.glutamicum . Мутант C. glutamicum Δ dtxR показал значительно замедленный рост в условиях высокого содержания CO2 / HCO3- (по сравнению с диким типом), но не в стандартных условиях. Это открытие подчеркивает важность главного регулятора для приспособленности клеток при высоких уровнях CO2 / HCO3- (Blombach et al., 2013). При низких уровнях CO2 / HCO3– C. glutamicum продемонстрировал три отдельные фазы роста. В средней фазе с самым медленным ростом C. glutamicum секретировал в среду l-аланин и l-валин и продемонстрировал примерно в два раза более высокую активность глюкозо-6-P дегидрогеназы и 6-фосфогльконатдегидрогеназы и сильный транскрипционный ответ ( > 100 генов с измененной экспрессией), включая повышенную транскрипцию почти всех генов тиаминпирофосфата (TPP) по сравнению со стандартными условиями.Мы предположили, что C. glutamicum противодействует недостатку CO2 / HCO3-, запуская биосинтез TPP для увеличения активности TPP-зависимых ферментов, участвующих в образовании CO ₂ (рисунок; Blombach et al., 2013).

Ячейки промышленного масштаба подвергаются воздействию различных градиентов, таких как pH, субстраты и растворенные газы. Для анализа влияния колебаний уровней CO2 / HCO3- на метаболизм и транскрипционный ответ C. glutamicum была разработана новая трехкомпонентная каскадная биореакторная система.pCO ₂ градиентов 75–315 мбар при значительном для отрасли времени пребывания около 3,6 мин не оказали значительного влияния на кинетику роста, но привели к 66 дифференциально экспрессируемым генам по сравнению с контрольными условиями. Интересно, что общее изменение экспрессии было напрямую связано с градиентами pCO ₂ и временем пребывания клеток в устройстве для уменьшения масштаба (Buchholz et al., 2014b).

CO2 / HCO3- Влияет на производственные процессы

Производственные процессы на гликолитических субстратах основаны на анаплеротической функции PCx и / или PEP-карбоксилазы для пополнения промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты, которые используются для анаболических требований и / или образования продукта.В частности, продукты на основе оксалоацетата, такие как l-лизин, требуют высокого анаплеротического потока. C. glutamicum — это рабочая лошадка в промышленном производстве l-лизина, обладающая карбоксилазой PCx и PEP. Несколько исследований идентифицировали PCx и особенно дерегулированные варианты как наиболее подходящие для улучшения поступления оксалоацетата, поскольку инактивация PCx снижала, а сверхэкспрессия соответствующего гена pyc значительно улучшала образование l-лизина у C. glutamicum (Peters-Wendisch et al., 2001; Ohnishi et al., 2002). Кроме того, инактивация PEP-карбоксикиназы приводила к увеличению продукции l-лизина с помощью C. glutamicum (Riedel et al., 2001). Удивительно, хотя были предприняты большие усилия для адаптации пути биосинтеза и оптимизации доступности прекурсоров (Blombach and Seibold, 2010), влияние измененных уровней CO2 / HCO3- на аэробную продукцию l-лизина до сих пор систематически не исследовалось.

Очевидно, слишком низкие уровни CO2 / HCO3- могут ограничивать активность анаплеротических реакций in vivo .Сочетание высокой аэрации и низкой концентрации биомассы в начале ферментации, вероятно, вызовет задержку роста клеток из-за чрезмерного удаления CO ₂ . По аналогии, установка неограничивающих уровней CO2 / HCO3- особенно важна для биопроцессов нулевого роста или покоя клеток. Примерами являются синтез органических кислот, таких как малат, фумарат и сукцинат, которые образуются анаэробно из оксалоацетата через восстановительное звено цикла лимонной кислоты. В таких условиях метаболизм клетки обеспечивает лишь незначительное количество CO2 / HCO3–.Однако повышенная продуктивность может быть достигнута путем барботирования CO ₂ или добавления карбонатов в среду для обеспечения достаточного количества HCO3- для C3-карбоксилирования (Inui et al., 2004; Okino et al., 2005, 2008; Lu et al. , 2009; Zelle et al., 2010; Zhang et al., 2010; Wieschalka et al., 2012). Inui et al. (2004) и Okino et al. (2005) показали, что добавление NaHCO ₃ к среде значительно улучшило скорость потребления глюкозы и скорость продукции сукцината с покоящимися клетками C.glutamicum R. Radoš et al. (2014) продемонстрировали, что барботирование анаэробной культуры нерастущих C. glutamicum CO ₂ улучшает выход сукцината и ацетата, соответственно, за счет продукции лактата. ¹³ C Ядерно-магнитный резонансный анализ паттернов мечения в конечных продуктах подтвердил включение бикарбоната и образование сукцината, главным образом, через восстановительное звено цикла лимонной кислоты (Radoš et al., 2014). Для двухфазного (аэробный рост, анаэробное производство) процесса производства сукцината с рекомбинантным E.coli , было также показано, что увеличение содержания CO ₂ в газовой фазе с 0 до 50% значительно улучшило удельную производительность биомассы и выход сукцината (Lu et al., 2009). Чтобы обеспечить дополнительный CO ₂ и восстановительные эквиваленты для анаэробного производства сукцината из глюкозы, Litsanov et al. (2012) интегрировали ген fdh , кодирующий формиатдегидрогеназу из Mycobacterium vaccae , в хромосому сконструированного C.glutamicum штамм. Добавление формиата увеличивало выход сукцината на 20% в основном за счет увеличения доступности НАДН. Однако часть образовавшегося CO ₂ была включена в продукт (Litsanov et al., 2012).

Нехватка нефтяных ресурсов и постоянно растущие цены на нефть стимулировали усилия по производству химикатов и топлива непосредственно из CO ₂ . Производство этанола, изобутиральдегида и изобутанола из CO ₂ и света было достигнуто с использованием сконструированных фотосинтетических бактерий, таких как Rhodobacter capsulatus и Synechococcus elongates PCC7942 (Wahlund et al., 1996; Ацуми и др., 2009). Ли и др. (2012) показали возможность электрохимической подачи электронов для производства изобутанола и 3-метил-1-бутанола из CO ₂ с помощью сконструированного R. eutropha h26. Однако низкая производительность и конечный титр таких подходов и конструкции реактора по-прежнему остаются проблемой для будущего промышленного применения. Альтернативно, RubisCO был функционально экспрессирован в гетеротрофных S. cerevisiae для включения CO ₂ в качестве вспомогательного субстрата, улучшающего выработку этанола и снижающего образование побочного продукта глицерина в культурах хемостата (Guadalupe-Medina et al., 2013). Инновационный подход заключается в использовании CO ₂ и водородсодержащих отходящих газов или синтез-газа в качестве сырья для производства химикатов и топлива с ацетогенными и карбоксидотрофными бактериями. Процессы аэробной и анаэробной газовой ферментации были использованы из-за их биотехнологического потенциала, и коммерческие предприятия по производству этанола уже строятся (Dürre and Eikmanns, 2015).

Клетки-продуценты млекопитающих происходят от грызунов (таких как мышь или хомяк) или тканей человека.В случае, если они используются в погруженной культуре, они претерпели (иногда) утомительный переход на урожай в суспендированных клеточных линиях-продуцентах. Имея в виду эту историю, можно понять, почему образование продуктов в клетках-продуцентах, таких как CHO, часто оказывается сильно несвязанным с ростом (Altamirano et al., 2001). Этот факт даже используется подходами с понижением температуры (от 37 до ~ 30 ° C) для остановки клеток в фазе G1, в конечном итоге увеличивая производство клеточно-специфического белка. По аналогии, увеличение осмоляльности приводит к сходным фенотипам роста и образования продуктов (Ozturk and Palsson, 1991; Kumar et al., 2007). Как указано в предыдущих разделах, повышенная среда pCO ₂ > 100 мбар, вероятно, будет ингибировать рост клеток для культур СНО. Следовательно, на кинетику образования терапевтического белка (типичного) несвязанного типа роста вряд ли повлияет среда с высоким pCO ₂ . Действительно, результаты Takuma et al. (2007) поддерживают этот вывод. В случае, если наблюдается образование продукта, связанного с ростом, влияние повышенных парциальных давлений диоксида углерода может быть более выраженным.Это также верно для предполагаемых взаимодействий высоких уровней CO2 / HCO3- с клеточной мембраной или белками-продуктами. Однако для изучения этих индивидуальных эффектов необходимы дополнительные исследования.

Заключение

Подводя итоги воздействия высоких уровней CO2 / HCO3–, можно сказать, что снижение клеточного роста является типичным явлением. Хотя эффекты очень индивидуальны, чувствительность к высоким парциальным давлениям CO ₂ у бактерий менее выражена, чем у грибов или клеток-продуцентов млекопитающих.Как показывает опыт, pCO ₂ > 100 мбар отмечает начало торможения роста для более позднего периода.

С другой стороны, слишком низкие уровни CO2 / HCO3– могут ограничивать анаплеротические реакции внутри клеток. Следовательно, последующие предшественники, такие как оксалоацетат, могут стать ограничивающими, что влияет не только на рост клеток, но и на биосинтез связанных продуктов метаболизма.

В целом, транскрипционные ответы на высокий (или низкий) CO2 / HCO3- изучены гораздо меньше, чем метаболические фенотипы.Однако (возможно) удивительные регуляторные механизмы ждут своего открытия. Наглядным примером является случай C. glutamicum , который направлен на противодействие ограничению CO2 / HCO3- путем усиления биосинтеза TPP, известного как важный кофактор декарбоксилирующих ферментов. Высокие уровни CO2 / HCO3-, по-видимому, служат важным стимулом для некоторых патогенных микробов, чтобы идентифицировать хозяина и запускать соответствующие программы инвазии. В какой степени фрагменты или производные таких регуляторных сценариев также присутствуют в других клетках, также еще предстоит выяснить.

При использовании микробов, дрожжей, грибов и клеток млекопитающих в промышленных биореакторах необходимо учитывать некоторые особенности. Высокие уровни CO2 / HCO3- не влияют на клетки как единичное, изолированное событие. Они скорее происходят в сочетании с изменениями осмоляльности и pH, которые многократно стимулируют клетки. Однозначное определение причин и последствий может быть затруднено по сути. Для выяснения деталей воздействия CO2 / HCO3– необходим комплексный сетевой анализ.Примерами являются связь между CO2 / HCO3- и продуктивностью с изменениями морфологии грибов или осмоляльностью CHO. С другой стороны, равные уровни pCO ₂ могут служить ценным критерием увеличения масштаба, поскольку они отражают сложное взаимодействие клеточной активности, перемешивания и массопереноса (Klinger et al., 2015). Кроме того, следует учитывать, что стимулы CO2 / HCO3– возникают динамически в условиях промышленной эксплуатации. Клетки циркулируют в промышленных реакторах, поэтому уровни растворенного CO ₂ часто меняются.Следовательно, всесторонние испытания на масштабирование должны отражать эти условия, чтобы гарантировать, что перспективные новые производители будут одинаково хорошо работать в больших масштабах — как они должны.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за финансирование этой работы Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), грант TA 241 / 5-1 и TA 241 / 5-2.Эта работа также была поддержана DFG в рамках программы финансирования Open Access Publishing.

Ссылки

• Абуайта Б. Х., Уити Дж. Х. (2009). Бикарбонат индуцирует экспрессию гена вирулентности Vibrio cholerae за счет повышения активности ToxT. Заразить. Иммун. 77, 4111–4120.10.1128 / IAI.00409-09 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Агилера Дж., Пети Т., Де Винде Дж. Х., Пронк Дж. Т. (2005). Психологические и общегеномные транскрипционные ответы Saccharomyces cerevisiae на высокие концентрации диоксида углерода.FEMS Yeast Res. 5, 579–593.10.1016 / j.femsyr.2004.09.009 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Altamirano C., Cairo J. J., Godia F. (2001). Разделение роста клеток и образования продуктов в клетках яичников китайского хомячка посредством метаболического контроля. Biotechnol. Bioeng. 76, 351–360.10.1002 / bit.10096 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Альтман П. Л., Диттмер Д. С. (редакторы) (1971). Биологические справочники: дыхание и кровообращение. Bethesda: Федерация американских обществ экспериментальной биологии.[Google Scholar]
• Артурс Г., Судхакар М. (2005). Транспорт углекислого газа. Продолжить. Educ. Анаэст. Крит. Уход за болью 5, 207–210.10.1093 / bjaceaccp / mki050 [CrossRef] [Google Scholar]
• Atsumi S., Higashide W., Liao J. C. (2009). Прямая фотосинтетическая переработка диоксида углерода в изобутиральдегид. Nat. Biotechnol. 27, 1177–1180.10.1038 / nbt.1586 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Бэджер М. Р., Прайс Г. Д. (2003). CO ₂ механизмы концентрации в цианобактериях: молекулярные компоненты, их разнообразие и эволюция.J. Exp. Бот. 54, 609–622.10.1093 / jxb / erg076 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Баез А., Флорес Н., Боливар Ф., Рамирес О. Т. (2009). Метаболический и транскрипционный ответ рекомбинантной Escherichia coli на повышенные концентрации растворенного диоксида углерода. Biotechnol. Bioeng. 104, 102–110.10.1002 / bit.22379 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Bahn Y. S., Mühlschlegel F. A. (2006). CO ₂ обнаружение грибов и не только. Curr. Opin. Microbiol. 9, 572–578.10.1016 / j.mib.2006.09.003 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Бейли Дж. Э., Оллис Д. Ф. (1986). Основы биохимической инженерии. 2 ^nd Edition, McGraw-Hill Chemical Engineering Series. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Макгроу-Хилл. [Google Scholar]
• Баллестра П., Да Силва А. А., Кук Дж. Л. (1996). Инактивация Escherichia coli углекислым газом под давлением. J. Food Sci. 61, 829–831.10.1111 / j.1365-2621.1996.tb12212.x [CrossRef] [Google Scholar]
• Бар-Эвен А., Нур Э., Льюис Н. Э., Майло Р. (2010). Дизайн и анализ синтетических путей фиксации углерода. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 107, 8889–8894.10.1073 / pnas.0
  6107 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Bäumchen C., Knoll A., Husemann B., Seletzky J., Maier B., Dietrich C. ., и другие. (2007). Влияние повышенных концентраций растворенного диоксида углерода на рост Corynebacterium glutamicum на D-глюкозе и L-лактате. J. Biotechnol. 128, 868–874. 10.1016 / j.jbiotec.2007.01.001 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Белу И., Пиньейро Р., Мота М. (2003). Периодическое культивирование Saccharomyces cerevisiae с подпиткой в ​​гипербарическом биореакторе. Biotechnol. Прог. 19, 665–671.10.1021 / bp0257067 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Blombach B., Buchholz J., Busche T., Kalinowski J., Takors R. (2013). Влияние различных уровней CO ₂ / HCO ₃ ^— на метаболизм и регуляцию у Corynebacterium glutamicum .J. Biotechnol. 168, 331–340.10.1016 / j.jbiotec.2013.10.005 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Бломбах Б., Зайболд Г. М. (2010). Углеводный обмен в Corynebacterium glutamicum и приложения для метаболической инженерии штаммов, продуцирующих L-лизин. Прил. Microbiol. Biotechnol. 86, 1313–1322.10.1007 / s00253-010-2537-z [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Bothun G. D., Knutson B. L., Berberich J. A., Strobel H. J., Nokes S. E. (2004). Метаболическая селективность и рост Clostridium thermocellum в непрерывной культуре при повышенном гидростатическом давлении.Прил. Microbiol. Biotechnol. 65, 149–157.10.1007 / s00253-004-1554-1 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Бухгольц Дж., Граф М., Бломбах Б., Такорс Р. (2014a). Улучшение углеродного баланса ферментации путем анализа общего углерода. Biochem. Англ. Дж. 90, 162–169.10.1016 / j.bej.2014.06.007 [CrossRef] [Google Scholar]
• Buchholz J., Graf M., Freund A., Busche T., Kalinowski J., Blombach B., et al. . (2014b). CO ₂ / HCO ₃ ^— возмущения смоделированных крупномасштабных градиентов в устройстве для уменьшения масштаба вызывают быстрые транскрипционные ответы у Corynebacterium glutamicum .Прил. Microbiol. Biotechnol. 98, 8563–8572.10.1007 / s00253-014-6014-y [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Кейси Дж. Р. (2006). Почему бикарбонат? 1. Биохим. Cell Biol. 84, 930–939.10.1139 / O06-184 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Castan A., Näsman A., Enfors S.-O. (2002). Подача воздуха, обогащенного кислородом, в процессах Escherichia coli : производство биомассы и рекомбинантного гормона роста человека. Enzyme Microb. Technol. 30, 847–854.10.1016 / S0141-0229 (01) 00490-2 [CrossRef] [Google Scholar]
• Chen S.Л., Гутмайнс Ф. (1976). Углекислый газ подавляет рост дрожжей при производстве биомассы. Biotechnol. Bioeng. 18, 1455–1462.10.1002 / bit.260181012 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Чен Ю., Канн М. Дж., Литвин Т. Н., Юргенко В., Синклер М. Л., Левин Л. Р. и др. (2000). Растворимая аденилатциклаза как эволюционно консервативный сенсор бикарбоната. Наука 289, 625–628.10.1126 / science.289.5479.625 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Chen Z., Bommareddy R. R., Frank D., Рэпперт С., Цзэн А.-П. (2013). Отмена регуляции ингибирования фосфоенолпируваткарбоксилазы по обратной связи для улучшения продукции лизина в Corynebacterium glutamicum . Прил. Environ. Microbiol. 80, 1388–1393.10.1128 / AEM.03535-13 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Chollet R., Vidal J., O’Leary M.H. (1996). Пируваткарбоксилаза: широко распространенный высоко регулируемый фермент в растениях. Анну. Rev. Plant Physiol. Завод Мол. Биол. 47, 273–298.10.1146 / annurev.arplant.47.1.273 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Коэльо М. А. З., Белу И., Пиньейро Р., Амарал А. Л., Мота М., Коутиньо Дж. А. П. и др. (2004). Влияние гипербарического стресса на морфологию дрожжей: исследование с помощью автоматического анализа изображений. Прил. Microbiol. Biotechnol. 66, 318–324.10.1007 / s00253-004-1648-9 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Cottier F., Raymond M., Kurzai O., Bolstad M., Leewattanapasuk W., Jiménez-López C., et al. (2012). Фактор транскрипции bZIP Rca1p является центральным регулятором нового пути восприятия CO ₂ у дрожжей.PLoS Pathog. 8: e1002485.10.1371 / journal.ppat.1002485 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Danckwerts P. V. (1951). Значение коэффициентов жидкой пленки при абсорбции газа. Ind. Eng. Chem. 43, 1460–1467.10.1021 / ie50498a055 [CrossRef] [Google Scholar]
• Дезенготита В. М., Шмельцер А. Э., Миллер В. М. (2002). Характеристика ответов гибридомных клеток на повышенный pCO ₂ и осмоляльность: внутриклеточный pH, размер клеток, апоптоз и метаболизм.Biotechnol. Bioeng. 77, 369–380.10.1002 / bit.10176 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Диксон Н. М., Келл Д. Б. (1989). Подавление CO ₂ роста и метаболизма микроорганизмов. J. Appl. Бактериол. 67, 109–136.10.1111 / j.1365-2672.1989.tb03387.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Dürre P., Eikmanns B.J. (2015). Источники углерода C1 для химического и топливного производства путем микробной газовой ферментации. Curr. Opin. Biotechnol. 35, 63–72.10.1016 / j.copbio.2015.03.008 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Эль-Саббаг Н., Харви Л. М., МакНил Б. (2008). Влияние растворенного диоксида углерода на рост, потребление питательных веществ, синтез цефалоспорина С и морфологию Acremonium chrysogenum в периодических культурах. Enzyme Microb. Technol. 42, 315–324.10.1016 / j.enzmictec.2007.10.012 [CrossRef] [Google Scholar]
• Эль-Саббаг Н., Макнил Б., Харви Л. М. (2006). Влияние растворенного диоксида углерода на рост, потребление питательных веществ, синтез и морфологию пенициллина в периодических культурах Penicillium chrysogenum .Enzyme Microb. Technol. 39, 185–190.10.1016 / j.enzmictec.2005.10.020 [CrossRef] [Google Scholar]
• Эрб Т. Дж. (2011). Карбоксилазы в естественных и синтетических микробных путях. Прил. Environ. Microbiol. 77, 8466–8477.10.1128 / AEM.05702-11 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Follonier S., Escapa IF, Fonseca PM, Henes B., Panke S., Zinn M ., и другие. (2013). Новые сведения о реорганизации транскрипции генов в Pseudomonas putida KT2440 при повышенном давлении.Microb. Cell Fact. 12, 30.10.1186 / 1475-2859-12-30 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Fuchs G. (2011). Альтернативные пути фиксации углекислого газа: понимание ранней эволюции жизни? Анну. Rev. Microbiol. 65, 631–658.10.1146 / annurev-micro-0-102801 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гарсия-Гонсалес Л., Гераерд А. Х., Спилимберго С., Элст К., Ван Гиннекен Л., Дебевере J., et al. (2007). Инактивация микроорганизмов в пищевых продуктах углекислым газом под высоким давлением: прошлое, настоящее и будущее.Int. J. Food Microbiol. 117, 1–28.10.1016 / j.ijfoodmicro.2007.02.018 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гиббс П. А., Севиур Р. Дж., Шмид Ф. (2000). Рост нитчатых грибов в погруженной культуре: проблемы и возможные решения. Крит. Rev. Biotechnol. 20, 17–48.10.1080 / 073885500177 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гётц Р., Гнанн А., Циммерманн Ф. К. (1999). Делеция карбоангидразоподобного гена NCE103 дрожжей Saccharomyces cerevisiae вызывает чувствительный к кислороду дефект роста.Дрожжи 15, 855–864.10.1002 / (SICI) 1097-0061 (199907) 15: 10A <855: AID-YEA425> 3.0.CO; 2-C [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Gray DR, Chen С., Ховарт В., Инлоу Д., Майорелла Б.Л. (1996). CO ₂ в крупномасштабной и высокоплотной перфузионной культуре клеток CHO. Цитотехнология 22, 65–78.10.1007 / BF00353925 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Guadalupe-Medina V., Wisselink HW, Luttik MA, de Hulster E., Daran J.-M., Pronk JT, et al. . (2013). Фиксация углекислого газа ферментами цикла Кальвина улучшает выход этанола в дрожжах.Biotechnol. Биотопливо 6, 125.10.1186 / 1754-6834-6-125 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Gutknecht J., Bisson M.A., Tosteson F.C. (1977). Диффузия диоксида углерода через двухслойные липидные мембраны: эффекты карбоангидразы, бикарбоната и неперемешиваемых слоев. J. Gen. Physiol. 69, 779–794.10.1085 / jgp.69.6.779 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Hall RA, de Sordi L., MacCallum DM, Topal H., Eaton R., Bloor JW и др. (2010).CO ₂ действует как сигнальная молекула в популяциях грибкового патогена Candida albicans . PLoS Pathog. 6: e1001193.10.1371 / journal.ppat.1001193 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ханке П. Д., Сински А. Дж., Уиллис Л. Б. (2005). Устойчивый к обратной связи ген пируваткарбоксилазы из Corynebacterium. Патент США № 6965021.
• Хэнсон Р. В., Решеф Л. (1997). Регулирование экспрессии гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы (GTP). Анну.Rev. Biochem. 66, 581–611.10.1146 / annurev.biochem.66.1.581 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Хартман Ф. К., Харпель М. Р. (1994). Структура, функция, регуляция и сборка D-рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы. Анну. Rev. Biochem. 63, 197–234.10.1146 / annurev.bi.63.070194.001213 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Hermann T. (2003). Промышленное производство аминокислот коринеформными бактериями. J. Biotechnol. 104, 155–172.10.1016 / S0168-1656 (03) 00149-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Хигби Р.(1935). Скорость абсорбции чистого газа неподвижной жидкостью в течение коротких периодов воздействия. Пер. Являюсь. Inst. Chem. Англ. 31, 364–389. [Google Scholar]
• Хо С. С., Смит М. Д. (1986). Влияние растворенного углекислого газа на ферментацию пенициллина: рост мицелия и производство пенициллина. Biotechnol. Bioeng. 28, 668–677.10.1002 / bit.260280506 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Инуи М., Мураками С., Окино С., Кавагути Х., Вертес А. А., Юкава Х. (2004). Метаболический анализ Corynebacterium glutamicum во время производства лактата и сукцината в условиях кислородной недостаточности.J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7, 182–196.10.1159 / 000079827 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Isenschmid A., Marison I. W., von Stockar U. (1995). Влияние давления и температуры сжатого CO ₂ на выживаемость дрожжевых клеток. J. Biotechnol. 39, 229–237.10.1016 / 0168-1656 (95) 00018-L [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Джардон М., Гарнье А. (2003). pH, pCO ₂ и влияние температуры на продукцию R-аденовируса. Biotechnol. Прог. 19, 202–208.10.1021 / bp025585a [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Джитрапакди С., Видаль-Пуиг А., Уоллес Дж. К. (2006). Анаплеротическая роль пируваткарбоксилазы в тканях млекопитающих. Клетка. Мол. Life Sci. 63, 843–854.10.1007 / s00018-005-5410-y [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Джонс Р. П., Гринфилд П. Ф. (1982). Влияние углекислого газа на рост и брожение дрожжей. Enzyme Microb. Technol. 4, 210–223.10.1016 / 0141-0229 (82)
  -5 [CrossRef] [Google Scholar]
• Kai Y., Мацумура Х., Иноуэ Т., Терада К., Нагара Ю., Йошинага Т. и др. (1999). Трехмерная структура фосфоенолпируваткарбоксилазы: предложенный механизм аллостерического ингибирования. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 96, 823–828.10.1073 / pnas.96.3.823 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Керн Д. М. (1960). Гидратация углекислого газа. J. Chem. Educ. 37, 14.10.1021 / ed037p14 [CrossRef] [Google Scholar]
• Кимура Р., Миллер В. М. (1996). Влияние повышенного pCO ₂ и / или осмоляльности на рост и продукцию рекомбинантного tPA клеток СНО.Biotechnol. Bioeng. 52, 152–160.10.1002 / (SICI) 1097-0290 (19961005) 52: 1 <152: AID-BIT15> 3.0.CO; 2-Q [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Klengel T., Лян WJ, Chaloupka J., Ruoff C., Schröppel K., Naglik JR, et al. (2005). Аденилилциклаза грибов интегрирует зондирование CO ₂ с передачей сигналов цАМФ и вирулентностью. Curr. Биол. 15, 2021–2026.10.1016 / j.cub.2005.10.040 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Klinger C., Schmidberger C., Eisenkraetzer D.(2015). Стратегии уменьшения масштабов процессов клеточных культур. Устная презентация на конференции DECHEMA «Увеличение и уменьшение масштаба биопроцессов». Гамбург. [Google Scholar]
• Knoll A., Bartsch S., Husemann B., Engel P., Schroer K., Ribeiro B., et al. (2007). Выращивание рекомбинантных дрожжей и бактерий с высокой плотностью клеток в условиях отсутствия давления и повышенного давления в биореакторах с мешалкой. J. Biotechnol. 132, 167–179.10.1016 / j.jbiotec.2007.06.010 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Knoll A., Майер Б., Черриг Х., Бюхс Дж. (2005). Кислородный массоперенос, ингибирование углекислого газа, отвод тепла, а также энергетическая и экономическая эффективность ферментации под высоким давлением. Adv. Biochem. Англ. Biotechnol. 92, 77–99.10.1007 / b98918 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kumar N., Gammell P., Clynes M. (2007). Стратегии контроля пролиферации для повышения продуктивности и выживаемости во время производственной культуры на основе СНО: краткое изложение использованных в последнее время методов и эффектов контроля пролиферации в продуктах, секретирующих клеточные линии СНО.Цитотехнология 53, 33–46.10.1007 / s10616-007-9047-6 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Курияма Х., Махакарнчанакул В., Мацуи С., Кобаяши Х. (1993) . Влияние pCO ₂ на рост и метаболизм дрожжей при непрерывной ферментации. Biotechnol. Lett. 15, 189–194.10.1007 / BF00133022 [CrossRef] [Google Scholar]
• Кусиан Б., Сюльтемейер Д., Боуэн Б. (2002). Карбоангидраза необходима для роста Ralstonia eutropha при концентрациях CO ₂ в окружающей среде.J. Bacteriol. 184, 5018–5026.10.1128 / JB.184.18.5018-5026.2002 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Li H., Opgenorth PH, Wernick DG, Rogers S., Wu T.- Y., Higashide W. и др. (2012). Интегрированное электромикробное преобразование CO ₂ в высшие спирты. Наука 335, 1596.10.1126 / science.1217643 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Лицанов Б., Брокер М., Ботт М. (2012). На пути к гомосукцинатной ферментации: метаболическая инженерия Corynebacterium glutamicum для получения анаэробного сукцината из глюкозы и формиата.Прил. Environ. Microbiol. 78, 3325–3337.10.1128 / AEM.07790-11 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Лопес М., Белу И., Мота М. (2014). Биореакторы с избыточным давлением: применение к культурам микробных клеток. Biotechnol. Прог. 30, 767–775.10.1002 / btpr.1917 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Лу С., Эйтман М. А., Альтман Э. (2009). Влияние CO ₂ на продукцию сукцината при двухфазной ферментации Escherichia coli . J. Biotechnol. 143, 213–223.10.1016 / j.jbiotec.2009.07.012 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Макинтайр М., Макнил Б. (1998). Морфогенетические и биохимические эффекты растворенного углекислого газа на мицелиальных грибах при глубинном культивировании. Прил. Microbiol. Biotechnol. 50, 291–298.10.1007 / s002530051293 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Merlin C., Masters M., McAteer S., Coulson A. (2003). Почему карбоангидраза необходима для Escherichia coli ? J. Bacteriol. 185, 6415–6424.10.1128 / JB.185.21.6415-6424.2003 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Мицухаши С., Охниши Дж., Хаяси М., Икеда М. (2004). Ген, гомологичный карбоангидразе бета-типа, необходим для роста Corynebacterium glutamicum в атмосферных условиях. Прил. Microbiol. Biotechnol. 63, 592–601.10.1007 / s00253-003-1402-8 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Мизиорко Х. М., Лоример Г. Х. (1983). Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза-оксигеназа.Анну. Rev. Biochem. 52, 507–532.10.1146 / annurev.bi.52.070183.002451 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Николау Б. Дж., Олрогге Дж. Б., Вуртеле Э. С. (2003). Биотинсодержащие карбоксилазы растений. Arch. Biochem. Биофиз. 414, 211–222.10.1016 / S0003-9861 (03) 00156-5 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Noorman H.J., Luijkx G.C.A., Luyben K.C., Heijnen J.J. (1992). Моделирование и экспериментальное подтверждение выделения углекислого газа в алкалофильных культурах. Biotechnol. Bioeng.39, 1069–1079.10.1002 / bit.2603 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ohnishi J., Mitsuhashi S., Hayashi M., Ando S., Yokoi H., Ochiai K., et al. (2002). Новая методология, использующая информацию генома Corynebacterium glutamicum для создания нового мутанта, продуцирующего L-лизин. Прил. Microbiol. Biotechnol. 58, 217–223.10.1007 / s00253-001-0883-6 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Окино С., Инуи М., Юкава Х. (2005). Продукция органических кислот Corynebacterium glutamicum при кислородном голодании.Прил. Microbiol. Biotechnol. 68, 475–480.10.1007 / s00253-005-1900-y [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Okino S., Noburyu R., Suda M., Jojima T., Inui M., Yukawa H. (2008). Эффективный процесс производства янтарной кислоты в метаболически модифицированном штамме Corynebacterium glutamicum . Прил. Microbiol. Biotechnol. 81, 459–464.10.1007 / s00253-008-1668-y [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Орловски А., Варгас Л. А., Айелло А., Альварес Б. В. (2013). Повышенный уровень диоксида углерода активирует NBCn1 Na ⁺ / HCO ₃ ^— котранспортер в эмбриональных клетках почек человека.Являюсь. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F1765 – F1774.10.1152 / ajprenal.00096.2013 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ozturk S. S. (1996). Инженерные задачи в системах культивирования клеток высокой плотности. Цитотехнология 22, 3–16.10.1007 / BF00353919 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Озтурк С. С., Палссон Б. О. (1991). Влияние осмолярности среды на рост, метаболизм и выработку антител гибридомы. Biotechnol. Bioeng. 37, 989–993.10.1002 / bit.260371015 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Park S.А., Ко А., Ли Н. Г. (2011). Стимуляция роста возбудителя желудочного сока человека Helicobacter pylori атмосферным уровнем кислорода при высоком давлении углекислого газа. BMC Microbiol. 11: 96.10.1186 / 1471-2180-11-96 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Peters-Wendisch PG, Schiel B., Wendisch VF, Katsoulidis E., Möckel B., Sahm H., et al. (2001). Пируваткарбоксилаза является основным узким местом для производства глутамата и лизина Corynebacterium glutamicum .J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 295–300. [PubMed] [Google Scholar]
• Пфизенмайер Дж., Такорс Р. (2015). «Клетка млекопитающего-хозяина», в Промышленной биотехнологии, под ред. Виттманна К., Ляо Дж. (Weinheim: Wiley-VCH Verlag;). [Google Scholar]
• Пронк Дж. Т., Иде Стинсма Х., Ван Дейкен Дж. П. (1996). Метаболизм пирувата в Saccharomyces cerevisiae . Дрожжи 12, 1607–1633.10.1002 / (SICI) 1097-0061 (199612) 12:16 <1607: AID-YEA70> 3.0.CO; 2-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Radoš D.X. I., Тернер Д. Л., Фонсека Л. Л., Карвалью А. Л., Бломбах Б., Эйкманнс Б. и др. (2014). Влияние CO ₂ на продукцию анаэробного сукцината Corynebacterium glutamicum : анализ потока углерода с помощью 13С-ЯМР. Прил. Environ. Microbiol. 80, 3015–3024.10.1128 / AEM.04189-13 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Repaske R., Repaske A.C., Mayer R.D. (1974). Контроль углекислого газа за период задержки и рост Streptococcus sanguis .J. Bacteriol. 117, 652–659. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ричард Л., Гийуэ С. Э., Урибеларреа Ж.-Л. (2014). Количественная оценка временной и долговременной реакции Saccharomyces cerevisiae на стресс углекислого газа различной интенсивности. Process Biochem. 49, 1808–1818.10.1016 / j.procbio.2014.07.020 [CrossRef] [Google Scholar]
• Riedel C., Rittmann D., Dangel P., Möckel B., Petersen S., Sahm H., et al. . (2001). Характеристика гена фосфоенолпируваткарбоксикиназы из Corynebacterium glutamicum и значение фермента для роста и производства аминокислот.J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 573–583. [PubMed] [Google Scholar]
• Ричи Р. Дж., Надольный К., Ларкум А. (1996). Движущие силы переноса бикарбоната в цианобактерии Synechococcus R-2 (PCC 7942). Plant Physiol. 112, 1573–1584. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Зауэр У., Эйкманнс Б. Дж. (2005). Узел ПЭП-пируват-оксалоацетат как точка переключения для распределения потока углерода в бактериях. FEMS Microbiol. Ред. 29, 765–794.10.1016 / j.femsre.2004.11.002 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Сеченов М. (1889). Über die Konstitution der Salzlösungen auf Grund ihres Verhaltens zu Kohlensäure. Z. Phys. Chem. 4, 117–125. [Google Scholar]
• Смит К. С., Ферри Дж. Г. (2000). Прокариотические углеангидразы. FEMS Microbiol. Ред. 24, 335–366.10.1016 / S0168-6445 (00) 00030-9 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Spilimbergo S., Bertucco A. (2003). Нетермическая инактивация бактерий плотным CO ₂ . Biotechnol.Bioeng. 84, 627–638.10.1002 / bit.10783 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Стреттон С., Гудман А. Э. (1998). Углекислый газ как регулятор экспрессии генов у микроорганизмов. Антони Ван Левенгук 73, 79–85.10.1023 / A: 1000610225458 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Stumm W., Morgan J. J. (1995). Водная химия: химическое равновесие и скорости в природных водах, 3-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Wiley. [Google Scholar]
• Такорс Р. (2012). Масштабирование микробных процессов: воздействия, инструменты и открытые вопросы.J. Biotechnol. 160, 3–9.10.1016 / j.jbiotec.2011.12.010 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Такума С., Хирасима К., Пирет Дж. М. (2007). Зависимость от ограничения глюкозы pCO ₂ влияет на рост клеток CHO, метаболизм и продукцию IgG. Biotechnol. Bioeng. 97, 1479–1488.10.1002 / bit.21376 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Талли Р. С., Боуг К. Л. (1975). Влияние бикарбоната на рост Neisseria gonorrhoeae : замена газообразного CO ₂ атмосферой.Прил. Microbiol. 29, 469–471. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ташиан Р. Э. (1989). Углекислые ангидразы: расширяющиеся взгляды на их эволюцию, проявление и функцию. Биологические исследования 10, 186–192.10.1002 / bies.950100603 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Трипп Б. К., Смит К., Ферри Дж. Г. (2001). Карбоангидраза: новые открытия для древнего фермента. J. Biol. Chem. 276, 48615–48618.10.1074 / jbc.R100045200 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Wahlund T.М., Конвей Т., Табита Ф. Р. (1996). Биоконверсия CO ₂ в этанол и другие соединения. ACS Div. Fuel Chem. Преп. 41, 1403–1405. [Google Scholar]
• Вишалка С., Бломбах Б., Ботт М., Эйкманнс Б. Дж. (2012). Производство органических кислот на биологической основе с использованием Corynebacterium glutamicum . Microb. Biotechnol. 6, 87–102.10.1111 / 1751-7915.12013 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ян Дж., Договски К., Хокинг Д., Таушек М., Перуджини М., Робинс-Браун Р. М. (2009). Опосредованная бикарбонатом стимуляция RegA, глобального регулятора вирулентности из Citrobacter rodentium . J. Mol. Биол. 394, 591–599.10.1016 / j.jmb.2009.10.033 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Занги Дж. А., Шмельцер А. Э., Мендоза Т. П., Кноп Р. Х., Миллер В. М. (1999). Концентрация бикарбоната и осмоляльность являются ключевыми детерминантами в ингибировании полисиалирования клеток CHO при повышенном pCO ₂ или pH. Biotechnol. Bioeng. 65, 182–191.10.1002 / (SICI) 1097-0290 (199

  ) 65: 2 <182: AID-BIT8> 3.0.CO; 2-D [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

• Zelle RM, de Hulster E., Kloezen W. ., Pronk JT, ван Марис AJA (2010). Ключевые условия процесса производства дикарбоновых кислот C ₄ в биореакторных культурах сконструированного штамма Saccharomyces cerevisiae . Прил. Environ. Microbiol. 76, 744–750.10.1128 / AEM.02396-09 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Zhang X., Ван Х., Шанмугам К. Т., Инграм Л. О. (2010). Производство L-малата с помощью метаболической инженерии Escherichia coli . Прил. Environ. Microbiol. 77, 427–434.10.1128 / AEM.01971-10 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Zhu MM, Goyal A., Rank DL, Gupta SK, Vanden Boom T., Lee SS (2005). Влияние повышенного pCO ₂ и осмоляльности на рост клеток CHO и выработку слитого с антителом белка B1: тематическое исследование. Biotechnol. Прог. 21, 70–77.10.1021 / bp049815s [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Зиппин Дж. Х., Левин Л. Р., Бак Дж. (2001). CO ₂ / HCO ₃ ^— чувствительная растворимая аденилатциклаза в качестве предполагаемого метаболического сенсора. Тенденции Эндокринол. Метаб. 12, 366–370.10.1016 / S1043-2760 (01) 00454-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

V0121658 | Хугверкастофан

% PDF-1.3 % 1048 0 объект > эндобдж xref 1048 231 0000000016 00000 н. 0000007092 00000 н. 0000007294 00000 н. 0000007348 00000 п. 0000007658 00000 н. 0000008419 00000 н. 0000009224 00000 н. 0000009386 00000 п. 0000009453 00000 п. 0000009644 00000 н. 0000011928 00000 п. 0000022885 00000 п. 0000022951 00000 п. 0000024666 00000 п. 0000024937 00000 п. 0000274318 00000 н. 0000274393 00000 н. 0000274482 00000 н. 0000274584 00000 н. 0000274635 00000 н. 0000274750 00000 н. 0000274801 00000 н. 0000274951 00000 н. 0000275002 00000 н. 0000275128 00000 н. 0000275179 00000 н. 0000275285 00000 н. 0000275336 00000 н. 0000275442 00000 н. 0000275493 00000 н. 0000275595 00000 н. 0000275646 00000 н. 0000275808 00000 н. 0000275859 00000 н. 0000275949 00000 н. 0000276051 00000 н. 0000276191 00000 н. 0000276242 00000 н. 0000276336 00000 н. 0000276442 00000 н. 0000276587 00000 н. 0000276638 00000 н. 0000276785 00000 н. 0000276935 00000 н. 0000277083 00000 н. 0000277134 00000 н. 0000277266 00000 н. 0000277402 00000 н. 0000277576 00000 н. 0000277627 00000 н. 0000277732 00000 н. 0000277842 00000 н. 0000278006 00000 н. 0000278057 00000 н. 0000278157 00000 н. 0000278244 00000 н. 0000278420 00000 н. 0000278471 00000 н. 0000278618 00000 н. 0000278770 00000 н. 0000278896 00000 н. 0000278946 00000 н. 0000279126 00000 н. 0000279176 00000 н. 0000279265 00000 н. 0000279351 00000 н. 0000279490 00000 н. 0000279540 00000 н. 0000279655 00000 н. 0000279792 00000 н. 0000279894 00000 н. 0000279944 00000 н. 0000280053 00000 н. 0000280103 00000 п. 0000280205 00000 н. 0000280255 00000 н. 0000280396 00000 н. 0000280446 00000 н. 0000280533 00000 н. 0000280647 00000 н. 0000280697 00000 н. 0000280824 00000 н. 0000280874 00000 н. 0000280974 00000 н. 0000281024 00000 н. 0000281074 00000 н. 0000281124 00000 н. 0000281224 00000 н. 0000281274 00000 н. 0000281398 00000 н. 0000281448 00000 н. 0000281581 00000 н. 0000281631 00000 н. 0000281756 00000 н. 0000281806 00000 н. 0000281856 00000 н. 0000281906 00000 н. 0000282006 00000 н. 0000282056 00000 н. 0000282106 00000 н. 0000282157 00000 н. 0000282249 00000 н. 0000282382 00000 н. 0000282536 00000 н. 0000282587 00000 н. 0000282718 00000 н. 0000282769 00000 н. 0000282820 00000 н. 0000282968 00000 н. 0000283019 00000 н. 0000283070 00000 н. 0000283121 00000 п. 0000283248 00000 н. 0000283363 00000 н. 0000283414 00000 н. 0000283535 00000 н. 0000283586 00000 н. 0000283703 00000 н. 0000283754 00000 н. 0000283899 00000 н. 0000283950 00000 н. 0000284086 00000 н. 0000284137 00000 н. 0000284188 00000 н. 0000284239 00000 н. 0000284349 00000 п. 0000284400 00000 н. 0000284508 00000 н. 0000284559 00000 н. 0000284664 00000 н. 0000284715 00000 н. 0000284818 00000 н. 0000284869 00000 н. 0000284920 00000 н. 0000284971 00000 н. 0000285121 00000 н. 0000285172 00000 н. 0000285299 00000 н. 0000285350 00000 н. 0000285401 00000 п. 0000285452 00000 н. 0000285602 00000 н. 0000285653 00000 н. 0000285812 00000 н. 0000285863 00000 н. 0000286045 00000 н. 0000286096 00000 н. 0000286272 00000 н. 0000286323 00000 н. 0000286427 00000 н. 0000286529 00000 н. 0000286680 00000 н. 0000286731 00000 н. 0000286895 00000 н. 0000286946 00000 н. 0000287110 00000 н. 0000287161 00000 н. 0000287212 00000 н. 0000287335 00000 п. 0000287386 00000 н. 0000287437 00000 н. 0000287488 00000 н. 0000287539 00000 н. 0000287635 00000 н. 0000287719 00000 п. 0000287770 00000 н. 0000287880 00000 н. 0000287931 00000 п. 0000288066 00000 н. 0000288117 00000 н. 0000288223 00000 п. 0000288274 00000 н. 0000288401 00000 п. 0000288452 00000 н. 0000288556 00000 н. 0000288607 00000 н. 0000288704 00000 н. 0000288755 00000 н. 0000288855 00000 н. 0000288906 00000 н. 0000289032 00000 н. 0000289083 00000 н. 0000289182 00000 н. 0000289233 00000 п. 0000289340 00000 п. 0000289391 00000 п. 0000289497 00000 н. 0000289548 00000 н. 0000289656 00000 н. 0000289707 00000 н. 0000289758 00000 н. 0000289809 00000 н. 0000289907 00000 н. 0000289998 00000 н. 00002 00000 н. 00002 00000 н. 00002